Метаболические параметры оценки жизнеспособности изолированных гепатоцитов

Содержание адениннуклеотидов, отношение АТФ/АДФ и концентрация АТФ в изолированных гепатоцитах как критерии их жизнеспособности

Параметры адениловой системы используются различными авто­рами в качестве основного метаболического критерия функциональ­ной полноценности и жизнеспособности этих клеток. Это и понятно, так как они являются ключевыми метаболитами, определяющими энергетический статус клетки. Способ­ность сохранять в гепатоцитах высокие значения АТФ и отношение АТФ/АДФ используется многими исследователями в качестве кри­терия адекватно подобранных для них условий выделения и пере­живания. Этому способствует, например, внесение в ин­кубационную среду различных субстратов , сыворотки и пр. В таких условиях концентрация АТФ и отношение АТФ/АДФ в клетках могут даже увеличиваться во времени.

И, наоборот, деградация АТФ после выделения клеток, сниже­ние отношения АТФ/АДФ и величины общего аденилатного пула суспензии рассматриваются как отражение неадекватных условий инкубирования гепатоцитов, ставящих под сомнение возможность их использования в этих условиях в качестве биологической модели для изучения специфических особенностей метаболизма печени. Так, например, инкубация гепатоцитов с бромбензеном, повреждающим плазматическую мембрану гепатоцитов, приводила к заметному падению в них концентрации АТФ во время инкубации. На гепатоцитах цыпленка показано, что отношение АТФ/АДФ зависит от способа получения клеток. Если их выделяли по методу Берри и Френда и получили суспензию с 92-96% неокрашенных гепатоцитов, отношение АТФ/АДФ было близко к 4 и практически не изменялось в течение часа инкубации. Если же клетки приготовляли бесперфузионным методом, используя технику срезов, то при таком же количестве неокрашенных клеток величина отношения АТФ/АДФ в свежевыделенных гепатоцитах была равна 2,8 и затем уменьшалась в течение последующего часа до 2,0. Это коррелировало со снижением внутриклеточной концентрации калия.

Использование значений различных параметров аденилатного пула в качестве критерия жизнеспособности клеток понятно, так как от состояния энергетической функции клетки зависит активность многих жизненно важных для гепатоцитов энергопотребляющих процессов, таких, как глюконеогенез, синтез мочевины, липогенез и др. Действительно, показаны прямые корреляции между измене­нием содержания адениннуклеотидов в гепатоцитах и глюконеогенезом, изменением содержания Na⁺ и К⁺ и величиной мембранного потенциала, а также транспортом Са²⁺.

Однако существуют разногласия по вопросу о связи параметров аденилатного пула с проницаемостью плазматической мембраны. По одним данным, они имеют высокую значимость положительной корреляции. Так, при повреждении клеток из-за продолжительного хранения на льду и последующего нагревания суспензии до 37°С величина АТФ/АДФ снижалась до 0,3 против 3,7 в свежеизолиро­ванных клетках и это совпадало с увеличением количества прокра­шенных клеток от 5% в норме до 95% при повреждении. Рез­кое снижение концентрации АТФ в гипоксических условиях также сопровождалось необратимыми изменениями клеточной мембраны культивируемых гепатоцитов.

В то же время имеются данные об отсутствии четкой корреля­ции между концентрацией АТФ в клетках и степенью прокрашиваемости суспензии гепатоцитов. Это подтверждается и на­шими исследованиями. Имеется лишь очень грубая корреляция между количеством прокрашенных трипановым синим гепатоцитов и изменениями концентрации АТФ.

Она сводится к тому, что при выделении гепатоцитов путем пер­фузии печени in situ (на наркотизированном животном) достаточно высокие значения АТФ можно получить лишь в том случае, если количество прокрашенных клеток в конечной суспензии окажется не более 20%. Несмотря на то что в последующие 60 минут количество прокрашенных клеток может даже несколько нарастать, концен­трация АТФ в таких клетках не только не уменьшается во времени, но даже увеличивается и достигает через 30-60 минут значений, близких к перфузируемой печени. При наличии в свежевыделенной суспензии гепатоцитов более 20% прокрашенных клеток содержа­ние АТФ в них резко падает до 0,4-0,2мкмоль/г влажного веса, хотя оно может еще несколько восстанавливаться в последующее. При увеличении числа клеток с поврежденными плазматическими мембранами до 50-70% эта способность теряется. При наличии же в суспензии 80% и более прокрашенных гепатоцитов они содержат мало АТФ и ее концентрация прогрессивно уменьшается до следо­вых количеств в течение 30-60 минут.

Из этих данных следует вывод, что содержание АТФ отражает не столько состояние плазматических мембран, сколько функцио­нальное состояние самих гепатоцитов, определяемое в данной си­туации, по-видимому, процедурой выделения в целом. Дополнительным подтверждением этому служат данные о содержании АТФ в гепатоцитах, которые были выделены путем перфузии печени после декапитации животных без наркоза. Содержание АТФ в них было очень низким даже в том случае, когда все клетки были практически непрокрашены, т.е. имели интактные плазматические мембраны, и оно не увеличивалось во время инкубации.

Таким образом, изменения параметров аденилатного пула (в том числе содержания АТФ в клетке) являются, видимо, более чувствительным тестом, определяющим функционально-метаболический статус гепатоцитов в целом, нежели изменения проницаемо­сти плазматической мембраны, оцениваемые по окраске трипано­вым синим. Эти изменения обнаруживаются до грубых нарушений плазматической мембраны и коррелируют с последним лишь в усло­виях сильных повреждений клеточного метаболизма, близких к патологии.

По-видимому, нельзя согласиться с мнением Баура и соавторов о том, что использование параметров аденилатного пула в качестве критериев жизнеспособности гепатоцитов менее информатив­но, нежели измерение содержания Na⁺ и К⁺, а также мембранного потенциала клетки, которые могут рассматриваться как парциальные регуляторы клеточного метаболизма, участвующие в поддер­жании гомеостаза клетки в условиях физиологической нормы. Даже небольшие изменения их значений, как правило, обратимы и не обя­зательно связаны с патологическими нарушениями. Их высокая реактивность в ответ на любое физиологическое и нефизиологическое воздействие делает затруднительным количественную оценку и стандартизацию наблюдаемого процесса. Истинный же регулятор­ный механизм должен иметь в своей основе способность сохранять в физиологических условиях постоянной концентрацию ведущих ре­гуляторных параметров, что мы и видим на примере концентрации АТФ и отношения АТФ/АДФ, значения которых падают ниже фи­зиологически необходимого уровня лишь в критических для клетки состояниях.

Параметры общего метаболизма в качестве критериев жизнеспособности гепатоцитов

В условиях in vivo клетка способна поддерживать внутренний гомеостаз и сохранять регуляции общего метаболизма. Это свой­ство лежит в основе жизнедеятельности организма, и степень сохра­нения гомеостаза после экстирпации клеточного или тканевого пре­парата определяет его функционально-метаболическую полноцен­ность in vitro. Для печени in vivo специфичны следующие основные процессы:

1. синтез альбумина,
   
   
2. синтез мочевины,
   
   
3. синтез глю­козы,
   
   
4. синтез желчных кислот,
   
   
5. метаболизм жирных кислот,
   
   
6. биотрансформация ксенобиотиков.

Свежеизолированные гепато­циты сохраняют интенсивность метаболизма по большинству пере­численных показателей, близкую к перфузируемой печени.

С помощью подбора сред и условий инкубации, способствующих оптимизации специфических метаболических свойств паренхиматоз­ных клеток, можно добиться того, что первые две функции будут осуще­ствляться с достаточно высокой скоростью, приближающейся к пер­фузируемой печени или печени in vivo. Так, например, синтез мочевины обнаруживает тесную зависимость от содержания в среде доноров аммония и некоторых интермедиатов этого обмена (напри­мер, орнитина), а также предшественников глюконеогенеза и суб­стратов цикла Кребса, которые необходимы для синтеза аспартата. Он осуществляется лучше в неотмытых клетках и отсутствует в от­мытых. Оба процесса находятся в прямой зависимости от интактности плазматической мембраны.

Характерным признаком метаболи­ческой полноценности гепатоцитов является низкая скорость утили­зации глюкозы и ее превращения в лактат. Первым признаком по­тери метаболической специфичности гепатоцитов считается переход к гликолитическому типу обмена, связанному с окислением глюкозы и других углеводов.

Синтез глюкозы является одной из основных функций печени, которая сохраняется лишь в интактных гепатоцитах. В гепатоцитах с ненарушенной селективной проницаемостью мембраны и инкуби­руемых без субстратов наблюдается высокая скорость глюконео­генеза из лактата, пирувата, фруктозы, аминокислот. Скорость глюконеогенеза из лактата (10мМ) может достигать 37мкМ глюкозы/г в час. Она уменьшается при сниже­нии жизнеспособности клеток и тесно коррелирует с концентрацией АТФ в них.

Большую роль в окис­лительно-восстановительном метаболизме гепатоцитов и его защите от многих внешних воздействий, в том числе химических соединений, играет глутатион. Его содержание в изолированных гепатоцитах варьирует в достаточно широких пре­делах. Уровень глутатиона в свежеизолированных гепатоцитах за­висит от режима перфузии и состава инкубационной среды. Так, например, бескальциевый этап выделения гепатоцитов при перфу­зии печени может способствовать увеличению истечения глутатиона из клеток печени через синусоидальную мембрану. Это является одной из причин необходимости сокращения времени перфузии на этом этапе до 10 минут, когда описываемый эффект не успевает еще развиться. Улучшение техники выделения гепатоцитов сопровожда­лось повышением уровня глутатиона в клетках. Поэтому снижение концентрации восстановленной его формы, а также увеличение его истечения из клетки могут служить показателем интенсивности раз­вития цитоксического эффекта при ее контакте с чужеродными аген­тами.

При длительном хранении содержание глутатиона также снижа­ется. Однако и это может быть предотвращено подбором сред, со­держащих предшественники глутатиона. Снижение содержания глутатиона во времени, как правило, коррелирует с интенсификацией ПОЛ и нарушением проницаемости плазматической мембраны гепатоцитов.

В поврежденных клетках чувствительность к гормонам отсутст­вует, так как высвобождающиеся неспецифические гидролазы разрушают гормональные рецепторы на поверхности плазматиче­ской мембраны. Именно поэтому гормональная рецепция в гепатоцитах была обнаружена сравнительно поздно, лишь с появ­лением совершенно интактных клеток. Стимуля­ция глюконеогенеза глюкагоном в гепатоцитах с истощенными за­пасами гликогена используется многими исследователями в каче­стве одного из важных критериев жизнеспособности гепатоцитов. Глюкагон активирует аденилатциклазу в плазма­тической мембране изолированных гепатоцитов. Наряду с этим в изолированных гепатоцитах установлена также гормональ­ная рецепция для инсулина, катехоламинов, вазопрессина, ангио­тензина, окситоцина, чувствительность различных параметров метаболизма к которым может использоваться в качестве критериев метаболической полноценности этих клеток.