Многолетний опыт работы с гепатоцитами показывает, что состояние плазматической мембраны есть специфический феномен, чутко реагирующий на самые небольшие воздействия на клетку. В результате происходят нарушение ее селективной проницаемости, потеря растворимых энзимов и дезорганизация работы клетки в целом. Поэтому различные способы оценки состояния плазматический мембраны являются важными тестами на сохранение функционального статуса клетки.
Прокрашиваемость клеток трипановым синим — тест на их жизнеспособность
Метод визуального контроля за состоянием проницаемости плазматической мембраны клеток был предложен еще в 50-х годах и в первом приближении отражает ее изменения. Неповрежденные мембраны непроницаемы для трипанового синего при кратковременной инкубации; при этом даже небольшие включения красителя в цитозоле свидетельствуют о нарушений интактности клеточной мембраны. Метод очень прост и дает возможность без специального оборудования получить ответ в течение нескольких минут.
Наиболее часто употребляемая рабочая концентрация трипанового синего — 0,2%. Сеглен рекомендует 0,6%-ный раствор. Для этого 150мг красителя разводят в растворе NaCl (125мг в 25мл воды). Смесь пропускают через фильтр с отверстиями = 0,22мкМ и доводят до общего объема 2мл. Этот основной раствор может длительное время храниться замороженным. Для окрашивания клеток 300мкл этого раствора добавляется к 100мкл суспензии (конечная концентрация трипанового синего равна, таким образом, 0,45%). Метод окрашивания гепатоцитов подробно описан Сегленом, а также другими авторами.
Для визуальной оценки повреждения клеток используется способность ядерных белков адсорбировать краску. Даже самое слабое окрашивание ядра является индикатором повреждения клеточной мембраны. Неповрежденные паренхиматозные клетки имеют желтый цвет и хорошо очерченную выпуклую поверхностную линию, отражающую свет. Они легко отличимы по этому признаку от темных поврежденных клеток даже без окрашивания в обычном световом микроскопе.
Процедура перенесения суспензии клеток в счетную камеру должна быть очень быстрой, чтобы предотвратить неспецифическую седиментацию клеток в пипетке. Покровное стекло притирается к камере до помещения туда суспензии. После этого на край стекла наносится капля суспензии и клетки с жидкостью засасываются в камеру капиллярными силами. Если же изменить порядок этой процедуры и притирать стекло на уже нанесенную каплю, может резко увеличиться количество поврежденных клеток.
Метод окрашивания трипановым синим имеет некоторые ограничения при своем использовании. Например, в присутствии заменителей крови либо альбумина могут иметь место артефакты окрашивания, так как краситель связывается в этом случае преимущественно с белками перфузата. Интенсивность окрашивания красителем может также различаться в зависимости от среды инкубации.
В клетках, окрашенных красителем, т.е. оцененных как поврежденные, отмечаются нарушения и по другим метаболическим параметрам, которые также используются в настоящее время в качестве критериев интактности плазматической мембраны гепатоцитов: потеря растворимых энзимов цитозоля и выход К+ из клетки, уменьшение включения аминокислот в белки и гликолитической активности, снижение мембранного потенциала.
Тест на жизнеспособность клеток по их прокрашиваемости трипановым синим выявляет необратимые изменения поверхности плазматической мембраны лишь при нейтральном pH, так как при повышении кислотности проницаемость клеток для красителя увеличивается.
В настоящее время считается возможным использовать в качестве модельной системы для экспериментальных целей суспензию гепатоцитов, в которой остаются непрокрашенными 80-95% клеток. В отдельных работах удается получить суспензии очень высокой чистоты, когда непрокрашенными остаются 95-98% клеток. Метаболические свойства суспензии гепатоцитов, в которых прокрашенные, т.е. поврежденные, клетки составляют всего 5-20%, близки к срезам и перфузируемой печени.
В силу своей простоты и достаточно высокой воспроизводимости метод окрашивания клеток трипановым синим общепринят как обязательный экспресс-метод оценки качества суспензии гепатоцитов. Тем не менее тест на трипановый синий, по-видимому, недостаточно чувствителен для выявления незначительных повреждений плазматической мембраны, о которых свидетельствуют, например, перераспределение ионов в интро- и экстрацеллюлярном пространстве. Это связано с тем, что краситель сам проникает в клетки и окрашивает их лишь тогда, когда плазматическая мембрана становится проницаемой для высокомолекулярных соединений, например белков, и не может идентифицировать более ранние нарушения ее селективности, когда она становится доступной для низкомолекулярных соединений. На серьезные ограничения метода окрашивания трипановым синим, используемого для оценки жизнеспособности изолированных гепатоцитов, и необходимость его дополнения другими методами обращали внимание многие исследователи.
Определение активности лактатдегидрогеназы
При повреждении плазматической мембраны из клеток происходит выход растворимых энзимов. Поэтому способность гепатоцитов терять растворимые ферменты рассматривается как один из важных критериев оценки состояния их плазматической мембраны.
Лактатдегидрогеназа является одним из таких цитозольных ферментов, достаточно просто определяемых биохимическими способами. Наряду с трипановым синим определение увеличения концентрации лактатдегидрогеназы во внеклеточной среде стало одним из наиболее распространенных тестов оценки состояния плазматической мембраны . Бауру и сотрудникам удалось установить прямую зависимость активности лактатдегидрогеназы в суспензионной среде (супернатанте) от количества поврежденных клеток. Однако чувствительность этого теста примерно такая же, как и для трипанового синего, и не имеет перед ним существенных преимуществ. .
Наряду с лактатдегидрогеназным тестом определяют выход других ферментов из цитозоля.
Выход К+ из клеток — тест на состояние плазматической мембраны
Хорошо известно, что поддержание постоянной внутриклеточной концентрации ионов калия является общим свойством большинства животных и растительных клеток. Неудивительно поэтому, что возможность использования величины концентрации внутриклеточного калия в качестве параметра, характеризующего общее состояние изолированных клеток и их плазматических мембран, была исследована сразу же, как только была осознана необходимость в поиске критериев жизнедеятельности гепатоцитов.
Содержание К+ и Na+ в неповрежденных свежеизолированных гепатоцитах (94% непрокрашенных трипановым синим клеток) составляет 109±9,1 и 47,0±13,4мМ соответственно, что близко к значениям, полученным в перфузируемой печени.
Абсолютная величина внутриклеточной концентрации калия может несколько варьировать в индивидуальных опытах от одного клеточного препарата к другому. Если исходная концентрация К+ в клетке мала, то она, как правило, не достигает контрольного уровня в ходе дальнейшей инкубации. Такой препарат отличается малой жизнеспособностью гепатоцитов даже при низкой (менее 10%) их прокрашиваемости трипановым синим, и в процессе дальнейшей инкубации они резко ухудшают свои метаболические качества.
Содержание калия в клетке чутко реагирует на самые разные воздействия. Так, использование бескальциевой среды инкубации приводит к снижению внутриклеточного калия от 363 до 250нм/мг сухого веса. Показана зависимость содержания К+ в клетке от температуры инкубации. Непродолжительное хранение суспензии изолированных гепатоцитов на льду ведет к снижению содержания калия в клетке. Оно вновь нарастает при увеличении температуры инкубации до 37°С. В гепатоцитах может наблюдаться обратимое поглощение ионов К+, зависящее от межмембранного транспорта других ионов и причин, обусловливающих его.
Сохранение достаточно высокой концентрации внутриклеточного калия — обязательное условие, необходимое как для нормального протекания важнейших метаболических процессов в клетке (гликолиза, белкового синтеза и т.д.), так и для поддержания на физиологическом уровне величины трансмембранной разности потенциалов. Таким образом, изменения внутриклеточного содержания калия могут сигнализировать как о мембранных, так и о плазматических нарушениях в клетке. Последние обязательно сопровождаются перераспределением ионного состава из-за неспособности клеток удерживать концентрационные различия в интра- и экстрацеллюлярном пространстве, и это в первую очередь касается калия и натрия. Аналогичные изменения ионного состава показаны для гепатоцитов.
Потеря К+ гепатоцитами и соответствующие изменения в отношении Na+/K+ начинаются до того, как наступают изменения в прокрашиваемости клеток трипановым синим или в содержании лактатдегидрогеназы. Так, снижение концентрации внутриклеточного калия в течение многочасовой инкубации клеток почти на 40% проходило на фоне практически неизмененного количества окрашенных клеток (6-8%). Гепатоциты, изолированные из печени цыпленка перфузионным и неперфузионным (из срезов) методами, имели существенно разное содержание внутриклеточного К+ (193 и 139нм/мг сухого веса соответственно), хотя они давали практически одинаковую реакцию на трипановый синий.
Таким образом, концентрация внутриклеточного калия является гораздо более чувствительным критерием, оценивающим повреждение плазматической мембраны клеток и функциональное состояние гепатоцитов, нежели окрашивание трипановым синим. Однако определение К+ в клетке — достаточно сложная процедура, требующая высокочувствительной измерительной аппаратуры либо селективных электродов, что ограничивает использование этого метода.
Оценка состояния плазматической мембраны гепатоцитов с помощью мембранного потенциала
Мембранный потенциал свежеизолированных интактных гепатоцитов равен 36,4±3,4мВ, что сравнимо с перфузируемой печенью (34мВ). Различные воздействия (изменение температуры, старение, высокие концентрации кальция в среде, любое повреждение или просто изменение проницаемости мембраны) влияют на величину мембранного потенциала, уменьшая ее. Эти изменения могут наступать до видимых изменений в степени прокрашиваемости клеток трипановым синим, и проявляются одновременно с изменением калий-натриевого баланса. У клеток с поврежденными мембранами мембранный потенциал может падать практически до нуля. Поэтому наряду с изменением К+ и Na+ он рассматривается как наиболее чувствительный критерий состояния плазматической мембраны и жизнеспособности гепатоцитов. Однако измерения мембранного потенциала пока еще достаточно сложны и малодоступны широкому кругу исследователей. Величину мембранного потенциала определяют по соотношению внутри- и внеклеточной концентрации одновалентных ионов (например, Сl-) или липофильных зондов типа тетрафенилфосфония.
Дыхание как критерий оценки состояния плазматических мембран изолированных гепатоцитов
Дыхательная активность изолированных гепатоцитов рассматривается многими исследователями в качестве одного из основных критериев оценки их жизнеспособности.
Наиболее характерным признаком повреждения мембраны гепатоцитов является очень низкая скорость эндогенного дыхания, близкая у отмытых клеток к нулю. Гепатоциты с неповрежденными мембранами обладают значительно более высокой скоростью эндогенного дыхания. Степень прокрашиваемости клеток трипановым синим связана обратной зависимостью со скоростью эндогенного дыхания суспензии. Аналогичные данные получены для гепатоцитов, инкубируемых в растворе, содержащем глюкозу.
Таким образом, различия в значениях суммарных скоростей дыхания суспензии гепатоцитов отражают вклад клеток с поврежденными мембранами и могут быть использованы в качестве критерия оценки относительного количества клеток в суспензии с интактными плазматическими мембранами и, видимо, интактной внутриклеточной структурой.
Существуют дополнительные специфические «дыхательные» тесты на проницаемость плазматических мембран гепатоцитов. Они основаны на неспособности ряда субстратов (интермедиатов ЦТК, в том числе сукдината, а также НАДН и НАДФН) проникать через неповрежденные мембраны клеток.
В интактных клетках сукцинат проникает через плазматическую мембрану с очень низкой скоростью. Считается, что только 5% потребляемого клеткой кислорода связано с утилизацией экзогенного сукцината, который участвует в метаболизме глюкозы. Известно также, что сукцинат не стимулирует дыхание перфузируемой печени и не накапливается в ее клетках. По этой причине он считается маркером интактности плазматической мембраны.
Однако в поврежденных гепатоцитах с нарушенной селективной проницаемостью плазматической мембраны сукцинат диффундирует в клетку и окисляется в ЦТК, сильно стимулируя дыхание. Это связано с тем, что сукцинатоксидазный путь окисления в дыхательной цепи митохондрий сохраняется в таких клетках высокоактивным, несмотря на морфологические изменения внешней мембраны митохондрий. Последняя является, видимо, причиной подавления функции НАД-зависимого пути окисления и неэффективности влияния на дыхание НАД-зависимых субстратов — интермедиатов ЦТК.
Чем больше в суспензии клеток с поврежденными мембранами, тем больше видимый эффект сукцината, стимулирующий эндогенное дыхание. В присутствии сукцината коэффициент дыхательного контроля суспензии гепатоцитов с большим количеством поврежденных клеток значительно выше, чем в срезах печени, где он не превышает 2,5-3,1.
Учитывая, что сукцинат практически не проникает через интактную плазматическую мембрану, при наличии в суспензии не менее 50% жизнеспособных клеток, окисляющих эндогенные субстраты, коэффициент дыхательного контроля сукцината не должен быть более 1,2-1,4 при его концентрации 1мМ. Сходные результаты имеются для клеток, предварительно преинкубированных в присутствии глюкозы.
Оценка изменения проницаемости плазматических мембран с помощью «сукцинатного теста», по-видимому, гораздо более информативна, нежели по прокрашиванию трипановым синим. Это демонстрируется на примере гепатотоксического вещества хлорпромазина. Хлорпромазин в очень низкой концентрации (5мкмоль) нарушает проницаемость плазматических мембран лишь к низкомолекулярным веществам. Это сразу же обнаруживается по появлению стимулирующего дыхание действия сукцината (1мМ). Трипановый синий не выявляет при этом никаких изменений в состоянии мембраны, так как никаких существенных различий в прокрашиваемости клеток не происходит. Она увеличивается лишь при концентрации хлорпромазина 50-100мкмоль, когда плазматическая мембрана становится проницаемой для белковых соединений. Выход лактатдегидрогеназы из гепатоцитов под влиянием хлорпромазина регистрируется при его концентрации 50мкмоль, а глутаматоксалоцетаттрансаминазы — при концентрации 100мкмоль.
В качестве дополнительного теста на состояние плазматической мембраны суспензии гепатоцитов может быть использован анализ действия на дыхание двух последовательных добавок сукцината в нарастающих концентрациях (1 и 10мМ). Эффекты этих двух концентраций различаются очень существенно при наличии в суспензии высокого количества окрашенных гепатоцитов. Они практически нивелируются, когда число прокрашенных клеток в суспензии не превышает 20%, что обусловлено низкой проницаемостью интактных плазматических мембран к этому субстрату, даже если он присутствует в среде в перенасыщающих концентрациях.
Плазматическая мембрана клеток непроницаема ни для НАДН, ни для НАДФН. Поэтому оба кофермента также можно использовать в качестве показателей состояния плазматических мембран изолированных гепатоцитов. Однако дыхательный тест на НАДН применим только при добавлении последнего на фоне эндогенного дыхания. Эффект очень слабо выражен, если гепатоциты преинкубировали в растворе, содержащем глюкозу. Ориентация метаболического потока в последнем случае, видимо, такова, что экзогенный НАДН сравнительно плохо используется клетками даже с поврежденными плазматическими мембранами.
