Транспорт аминокислот в гепатоцитах

Способность к трансмембранному переносу аминокислот прису­ща всем клеткам животного и растительного происхождения. Так как изучение кинетики этого процесса методически возможно лишь на изолированных клетках, то основные представления о трансмембранном переносе аминокислот были получены из эксперимен­тов с бактериальными клетками, ретикулоцитами, клетками крови и т.п. Было показано, что существуют несколько типов транспорт­ных систем для аминокислот, обладающих сходными кинетическими характеристиками в разных клетках.

• Система А — для переноса коротких, нейтральных аминокис­лот, таких, как аланин, глицин, 2-аминоизобутировая кислота или ее N-метилированное производное — неметаболизирующийся аналог аланина.
  
  
• Система L — переносящая разветвленные и ароматические аминокислоты.
  
  
• Система Гли — специфичная для глицина.
  
  
• Система N — для субстратов с N-содержащими цепями — глутамина, аспарагина, гистидина.
  
  
• Система бета — обеспечивающая поглощение бета-аминокислот.
  
  
• Система ASC— для переноса аланина, серина, цистеина.

Имеется много доказательств существования переносчиков для активного транспорта аминокислот, но ни один из них еще не иден­тифицирован. Поэтому общность транспортных систем в разных клетках устанавливается только на основании кинетических данных по переносу отдельных аминокислот и регуляторных характеристик такого переноса. Изучение трансмембранного переноса аминокис­лот в печени началось, когда появились интактные изолированные гепатоциты, т.е. в конце 70-х годов. При наличии поврежденных плазматических мембран создавалась иллюзия почти свободного доступа аминокислот в гепатоциты.

Хорошо известно, что транспорт аминокислот регулируется по­требностями клеток и потому может являться характеристикой как обеспеченности синтетических процессов субстратами, так и состоя­ния транспортных процессов в плазматической мембране гепатоцитов. Одним из самых важных и интересных свойств транспортных систем нейтральных аминокислот в клетках животных является их способность к адаптивной регуляции. Сущность ее заключается в том, что после более или менее длительной инкубации клеток в сре­де, не содержащей аминокислот, кинетические параметры транспор­та некоторых аминокислот в клетки меняются. Наблюдаемые сдвиги не обеспечивают постоянства внутриклеточной концентрации ами­нокислот сами по себе при колебаниях их содержания в среде ин­кубации клеток, но они существенны для сохранения регуляторного действия, которое оказывает величина аминокислотного пула в клетке на трансмембранный транспорт аминокислот. Данные об адаптивной регуляции в гепатоцитах, как, впрочем, и в других клет­ках, еще не полны.

Существуют заметные различия в ответе транспортных систем на исключение аминокислот из среды инкубации в свежеизолиро­ванных гепатоцитах, гепатоцитах в культуре и неопластических клетках. Наиболее четко наличие адаптивной регуляции в них показано для субстратов системы А. Увеличение скорости вса­сывания аминокислот после аминокислотного голодания частично или полностью блокируется как циклогексимидом, так и актиномицином Д. Удаление ингибиторов синтеза белков и нуклеиновых кислот из среды инкубации вновь увеличивает скорость транспорта аминокислот. Дополнительный синтез аминокислотных пере­носчиков, возникающий при указанной депривации, является, по-видимому, одним из молекулярных механизмов адаптивной регу­ляции.

При инкубации клеток в среде, свободной от аминокислот, про­исходит снятие эффекта трансингибирования (т.е. взаимного инги­бирования транспорта) субстратами данных систем, что является прямым следствием депривации. Адаптивной регуляции, безусловно, подвержена Na⁺-зависимая компонента транспорта. Однако замена внеклеточных ионов Na⁺ на непроникающий холин не всегда ска­зывается на скорости аминокислотного транспорта. Ве­роятно, это связано с тем, что Na⁺-независимая компонента системы А обусловлена простой диффузией аминокислот через клеточную, мембрану.

Система N тоже способна к адаптивному усилению транспорта субстратов (глутамина) после аминокислотного голодания.

Субстраты различных систем оказывают трансингибирующее действие на увеличение скорости транспорта, однако имеется неко­торое несоответствие между подавляющим и субстратным дей­ствием аминокислот. Так, метилированное производное аминоизобутирата (субстрат системы А) эффективно подавляло адаптивную регуляцию транспорта глутамина (субстрат системы N). Подавле­ние было практически одинаковым при концентрациях метиламиноизобутирата, различающихся более чем на порядок.

Аналогично этому цистеин, который не является субстратом ни для системы А, ни для системы N, оказался эффективным репрессором последней. Эти факты показывают, что за подавление транс­порта аминокислот ответственны только субстраты, способные связываться со специфическими рецепторами.

Скорость транспорта лейцина — субстрата Na⁺-независимой си­стемы L — после инкубации гепатоцитов нормальных животных в среде, не содержащей аминокислот, лишь незначительно увеличи­вается при длительном (порядка 20 часов) голодании. Однако для кле­ток гепатомы показан 2-фазный характер аккумуляции этого суб­страта — резкое уменьшение в течение первых 2 часов сменяется значительным увеличением в последующем.

Сродство лейцина к системе А в клетках гепатомы значительно выше, чем в нормальных гепатоцитах. Скорость поглощения лей­цина в неопластических клетках также существенно (в 5-10 раз) выше, чем в гепатоцитах. Первоначальное снижение скорости транспорта лейцина вызывается резким снижением его концентра­ции во внеклеточной среде; дальнейшее увеличение всасывания объясняется возросшей активностью системы А. Эти примеры наглядно демонстрируют различие в организации транспортных си­стем нормальных и трансформированных клеток печени.

Физиологическая роль адаптивной регуляции может заключать­ся в воздействии на метаболизм аминокислот опосредованно через поддержание внутриклеточной их концентрации и баланса между вне- и внутриклеточным их содержанием. Эффект, который оказывает аминокислотное голодание на транспорт какого-либо субстрата в клетку, может быть связан с зависимостью метаболиз­ма и транспорта для данного субстрата. Возможно, это обстоятельство лежит в основе наблюдаемых резких различий в проявлении адаптивной регуляции в свежеизолированных, культивируемых нормальных и трансформированных гепатоцитах.

В настоящее время мало что можно сказать об относительной мощности различных транспортных систем. Для некоторых клеток доказано отсутствие специализированных транспортных систем. По­казано, например, что в эритроцитах нет системы А, нет транспорт­ной системы для анионных аминокислот в клетках Эрлиха. Если сравнить общее количество систем, найденных для клеток одного вида, то оно наибольшее в клетках печени (как нормальных, так и трансформированных). Так как ни одна из транспортных систем структурно не идентифицирована, то проводить параллели при описании свойств этих систем в различных клетках нужно с изве­стной осторожностью. По всей вероятности, системы A, ASC и си­стема для транспорта бета-аминокислот в гепатоцитах в общих чертах похожи на аналогичные системы в разных клетках животных.

Есть основания считать, что система L наиболее характерна именно для гепатоцитов. Ей присущ ряд свойств, не наблю­даемых у других систем транспорта нейтральных аминокислот. Так, количественные характеристики их облегченной диффузии в куль­туре гепатоцитов из эмбриональной и взрослой печени существенно отличаются.

Транспорт субстратов системы N (гистидина) происходит одина­ково как в клетках эмбриональной печени, так и в полностью диф­ференцированных клетках. Гистидин конкурентно подавляет транспорт глутамина во всех указанных типах гепатоцитов.

Система N имеет общие субстраты с другими системами транс­порта аминокислот (например, глютамин, который является неспе­цифичным для системы А, транспортирующей его в гепатоциты с низкой скоростью).

Большинство рассматриваемых транспортных систем Na-зависимы. Для системы А показано существование Na-независимой компоненты, появляющейся при стимуляции аминокислотного транспорта (аминокислотное голодание, внесение экзогенных гормонов). Для Nа-независимого транспорта не обнаружено способ­ности к насыщению субстратом, что указывает на диффузионный механизм переноса аминокислот. Интересные данные были получены для глутамина, который может транспортироваться не только Na-зависимой системой, но и Na-независимым путем. Этот перенос происходит по типу облегченной диффузии и играет минор­ную роль в общем транспорте глутамина в направлении из среды в клетку при физиологических концентрациях. Однако для выхода глутамина из клетки Na-независимая компонента играет существен­ную роль. Физиологическое значение этого феномена пока неясно.

Очевидно, что из всех систем, осуществляющих транспорт ней­тральных аминокислот в гепатоцитах, только система L является существенно Nа-независимой.

Культивируемые гепатоциты имеют две Na-независимые систе­мы: L₁ и L₂, ответственные за перенос субстратов системы L и резко отличающиеся по своим кинетическим свойствам. Система L₁ имеет бифазную кинетику, и величина ее К_м (10^-3М) на три по­рядка выше, чем для системы L₂ (1-3 х 10^-3М). В свежевыделен­ных гепатоцитах система L₂ высоко активна. Эта активность замет­но снижена у клеток в культуре через 24-48 часов после выделения.

Удельная доля системы L₂ для переноса лейцина при его кон­центрации в среде 50мкМ составляла через 4 и 24 часа культивирова­ния 94 и 70% соответственно. Наоборот, скорость транспорта в си­стеме увеличивалась на 50-100% в период от 12 до 24 часов куль­тивирования. Это увеличение блокировалось ингибиторами белко­вого синтеза.

Система L₁ полностью ингибировалась цистеином, валином, лей­цином, изолейцином, метионином, гистидином, триптофаном, фенил­аланином и тирозином. Систему L₂ сильно ингибировали валин, лей­цин, фенилаланин и, в меньшей степени, гистидин, цистеин, изолей­цин, метионин. Есть указания на то, что система L₁ имеет аналог в других клетках — систему Т для эритроцитов. Системы L₁ и L₂ субстратспецифичны: в клетках печени, культивируемых 24 часа, удельный вклад этих систем в поглощение гистидина (50мкМ) составлял 75 и 25% соответственно, а поглощение лейцина при та­кой же внеклеточной концентрации составляло соответственно 30 и 70%.

Na-независимый транспорт гистидина в гепатоцитах из взрослой и эмбриональной печени увеличивался по мере культивирования, несмотря на существенное (на два порядка) различие в абсолютных скоростях его транспорта в этих клетках.

Эти данные показывают, что нельзя ни одну из этих систем в отдельности полностью отождествить с системой L. Существен­но, что в отличие от обычных гепатоцитов в клетках гепатомы НТС Na-независимый транспорт аминокислот осуществляется одной си­стемой К_м = 250мкМ.

Заканчивая рассмотрение транспорта аминокислот в гепатоци­тах, нельзя не упомянуть о системе переноса катионных аминокис­лот — У⁺-системе . Ее субстратом является аргинин. В гепа­тоцитах в отличие от других клеток, в том числе и гепатомы НТС, мощность У⁺-системы очень мала. Физиологическая значимость этого может заключаться в том, что транспорт аргинина в клетки печени является лимитирующим фактором для его гидролиза арги­назой. Активность аргиназы в печени намного больше (примерно в 20 раз), чем в других тканях. Поэтому в гепатоцитах аргинина очень мало по сравнению с другими тканями. Наличие активной У⁺-системы в печени несовместимо с существованием эффективного цикла мочевины. Появление системы Y⁺ в гепатоцитах может слу­жить сигналом начала патологических нарушений.

Системы транспорта аминокислот неодинаково зависят от мета­болического статуса гепатоцита. Например, транспорт аланина в клетки, изолированные из печени голодных крыс, при физиологиче­ских концентрациях (1мМ) на 80% выше, чем в клетках, полученных от сытых крыс; 2-аминоизобутировая кислота в концентрации 0,1мМ поглощается гепатоцитами из печени голодных крыс при­близительно в 20 раз интенсивнее, чем клетками, изолированными из печени сытых животных. В то же время поглощение глютамина не стимулируется голоданием, что является дополнительным под­тверждением множественности механизмов, контролирующих транс­порт аминокислот в печени. В гепатоцитах, подобно другим клеткам, может существовать гормональная регуляция работы си­стем, транспортирующих нейтральные аминокислоты в клетки. Эта стимуляция осуществляется почти исключительно через систему А и лишь частично через системы L (Na-независимый транспорт) и N. Большинство исследований гормональной регуляции амино­кислотного транспорта выполнено с 2-аминоизобутиратом, специ­фичным субстратом системы А.

Показано, что глюкагон, инсулин, катехоламины, гормон роста и глюкокортикоиды регулируют транспорт аминокислот в гепато­цитах. Преинкубация клеток с глюкагоном или инсулином ведет к появлению дополнительной компоненты транспортной си­стемы с более высоким сродством (К_м = 1мМ), чем основная ком­понента (К_м = 40мМ). Максимальная стимуляция транспорта (в 2-5 раз) наблюдалась при низких концентрациях субстрата. Дей­ствие инсулина и глюкагона аддитивно. Предполагается, что инсу­лин и глюкагон действуют на транспорт аминокислот опосредован­но, через стимуляцию синтеза компонентов транспортной системы, с высоким сродством к субстрату. Присутствие гормона необходимо только на первом этапе запуска синтеза. В отличие от клеток в культуре в свежевыделенных гепатоцитах нет латентного периода для гормональной стимуляции, так же как и в клетках перфузируе­мой печени. Эти результаты свидетельствуют о наличии двух фаз стимуляции системы А в гепатоцитах: в первой она не зависит от интенсивности макромолекулярного синтеза de novo; вторая фаза стимуляции определяется белковым синтезом.

Существует и другой путь действия гормонов, состоящий в гиперполиризации мембран за счет повышения проницаемости для К⁺ и уменьшения проницаемости для Na⁺. Это оказывает воздействие на Na-зависимый механизм работы системы А. Такой же результат получается при гормональном воздействии на Na⁺, К⁺- АТФазу.

В некоторых работах имеется указание на непосредственную активацию транспорта аминокислот в гепатоцитах под влиянием гормонов, но возможный механизм такого действия совершенно неясен.