Эндоцитоз — процесс проникновения в клетку растворенных веществ с большим молекулярным весом путем их захвата клеточной поверхностью и транслокации в интрацеллюлярное пространство в мембранной упаковке — играет, по всей видимости, чрезвычайно большую роль в ее жизни. Есть основания полагать, что именно с эндоцитозом связано попадание в клетку большинства высокомолекулярных ксенобиотиков, и в том числе токсинов. Несмотря на то что физиологическая значимость клеточного эндоцитоза еще не полностью ясна, очевидно, что способность к нему есть одна из важнейших характеристик физиологического состояния клетки.
Схематически процесс может быть описан следующим образом: на первом этапе происходит связывание гликопротеида с рецептором, находящимся на внешней стороне плазматической мембраны. Затем комплекс гликопротеид — рецептор попадает в клетку и переносится в ней для дальнейшей деградации лизосомальными ферментами. Наконец, происходят освобождение рецептора, его «реутилизация» или доставка к плазматической мембране для повторного цикла. Физиологическая значимость всех функций, выполняемых рецептором асиалопротеидов, неизвестна. Есть основания предполагать, что эти белки участвуют в иммунном ответе клетки и что цитотоксическое действие некоторых веществ включает взаимодействие с ними. Необходимо отметить, что в условиях целого организма сиаловые остатки углеводной части гликопротеидов существенны для нормальной циркуляции последних в крови.
Десиализированные нейроаминидазой гликопротеиды исчезают из циркуляции из-за их быстрого попадания в печень. В свою очередь, специфичность и скорость рецепции этих соединений плазматической мембраной гепатоцитов зависят от их галактозных остатков. По-видимому, именно рецепция гликопротеидов определяет способность клетки к эндоцитозу.
Существует значительное различие в числе действующих рецепторов на мембранах паренхиматозных клеток печени in situ и in vitro .
Вопрос о сохранности рецепторов гликопротеидов в изолированных гепатоцитах изучен мало. Однако при неперфузионном, механическом способе их выделения поглощение асиало-орозомукоида идет с очень низкой скоростью, а белоксвязывающая активность рецепторов эндоцитоза в 3 раза меньше, чем в клетках, полученных перфузионным способом. Это указывает на отличия в состоянии клеточной поверхности гепатоцитов, полученных разными способами.
При изоляции может произойти необратимое изменение кинетических параметров рецепции, выявляемое в ходе культивирования клетки. Примером может служить изменение кинетических характеристик рецепции составного гликопротеида, образующегося при гемолизе (комплекс гемоглобин — гаптоглобин). Для рецепторов этого комплекса, находящегося на поверхности плазматических мембран, изолированных из печени, были найдены два центра связывания: один — с высоким сродством к гликопротеиду, второй — с низким. Для свежеизолированных гепатоцитов, так же как и для клеток в первичной культуре, удалось установить лишь один центр связывания у рецепторов плазматической мембраны с низким сродством к лиганду. Уменьшение сродства рецептора к гликопротеиду коррелировало со снижением скорости интернализации и распада молекул этого комплекса в изолированных гепатоцитах. Ухудшение кинетических характеристик связывания при обработке клеток коллагеназой отмечено также для липопротеидов низкой плотности и инсулина.
В изолированных гепатоцитах содержание внутриклеточных рецепторов асиалопротеидов составляет 90-95% от общего пула и только 5-10% их находятся на внешней стороне клеточной поверхности. Эти рецепторы не участвуют в процессе эндоцитоза. Константа их диссоциации почти на два порядка ниже кажущейся Км для поглощения асиалогликопротендов перфузируемой печенью.
Показано, что функциональная активность работающих рецепторов плазматической мембраны сохраняется, даже если их число существенно снижается при изоляции клеток. Интернализация гликопротеида в клетку происходит с полупериодом 3-6 минут, длительность которого не зависит от числа занятых рецепторов в клетке.
В свежевыделенных гепатоцитах около 30% рецепторов поверхности находятся в «нерабочем» состоянии и активируются при обработке клеток ЭДТА. Этот «запасной пул» рецепторов неотличим от активных рецепторов, работающих в свежевыделенных гепатоцитах, и имеет такие же характеристики связывания. Число рецепторов на плазматической мембране обратимо увеличивается с ростом температуры от 25 до 37°С и уменьшается при ее понижении. В культуре гепатоцитов при 37°С их количество достигало 6,7х104 на клетку. Скорость эндоцитоза в изолированных гепатоцитах зависит от температуры и лимитируется при 10-20°С. Распад комплекса рецептор — гликопротеид в клетках при 20°С резко замедляется. Характерно, что лизосомальный аутолиз и распад инсулина также не наблюдаются при температурах ниже 20°С.
Все это дает основание считать, что в изолированных гепатоцитах эндоцитоз, опосредованный через рецептор гликопротеидов плазматической мембраны, регуляторно связан с деградацией интернализируемых гликопротеидов лизосомальными ферментами. В то же время при определенных условиях возможен распад комплекса рецептор — гликопротеид и без участия лизосомальных ферментов. Высвобождаемый при этом рецептор возвращается к поверхности клеточной мембраны. Электронномикроскопические наблюдения показали, что один рецептор может совершить до 20 циклов интернализации молекул гликопротеидов в гепатоцит.
Если процессы, определяющие судьбу лиганда в клетке, в общих чертах изучены, то все, что касается дальнейшего существования рецептора после распада комплекса, остается проблематичным. Доказательства в пользу существования реутилизации освобожденных рецепторов в эндоцитозе очень убедительны. Так, например, циклогексимид, ингибирующий белковый синтез, уменьшает количество асиало-орозомукоидов, метаболизирующихся в клетке при 37°С, в течение 3х часов приблизительно в 2 раза. Это указывает на отсутствие синтеза рецепторов асиалогликопротеидов de novo. Однако в этих условиях клетки метаболизируют в 34 раза больше асиало-орозомукоидов, чем могут связывать рецепторы на их поверхности. Каждая молекула рецептора может быть ответственна за исчезновение многих молекул лиганда. Период полураспада рецептора эндоцитоза составляет приблизительно 20 часов, а для других белков плазматической мембраны гепатоцитов — около 85 часов.
В последнее время появились данные о том, что рецептор гликопротеидов на плазматической мембране относится к классу фосфопротеидов. Если это так, то можно ожидать, что эндоцитоз гликопротеидов является АТФ-зависимым процессом.
На изолированных гепатоцитах показано, что лигандсвязывающие свойства рецептора гликопротендов могут меняться при поглощении клеткой агентов, изменяющих величину pH и содержание Ca2+. Предполагается, что этот сдвиг pH и уровня кальция влияет как на скорость распада комплексов лиганд — рецептор, так и на скорость возвращения рецептора к поверхности клетки. Эта регуляция наблюдалась при добавлении в среду инкубации ионофоров Na+ монензина и нигерицина и оказалась специфичной для гликопротеида галактозо-К-ацетилгалактозоамина, но не гликопептида фетуин-Г2. У этих же соединений отмечен различный характер влияния температуры на процесс связывания. Монензин влияет на реутилизацию рецептора, но не сказывается на процессе интернализации лиганда в клетку. Эти данные говорят о вероятности существования и иных механизмов регуляции.
