В настоящее время установлено, что накопление продуктов перекисного окисления липидов в мембранах эндоплазматического ретикулума печени in vivo сопровождается общим снижением активности системы оксигеназ со смешанной функцией и деградацией терминального компонента этой системы цитохрома Р-450. Наблюдается достоверная обратная корреляция (г = -0,81) между содержанием цитохрома Р-450 и концентрацией продуктов ПОЛ микросомальной фракции печени животных при различных патологиях (Е-авитаминоз, ишемия и др.), а также в нормальных физиологических условиях, при индукции системы монооксигеназа различными ксенобиотиками.
Наряду с этим известно достаточное число фактов, указывающих на нестабильность цитохрома Р-450 в культуре гепатоцитов и возможность разными путями частично устранять причины деструкции цитохрома Р-450. Первое находит несколько объяснений: повышение активности гемоксигеназы; недостаточность окисленного никотинамида, метаболизм эндогенных субстратов цитохрома Р-450 и др. Предотвращению этого явления способствует подбор определенных сред культивирования клеток печени, содержащих, например, предшественник синтеза гема — 5-аминолевулиновую кислоту, вещества, являющегося лигандом к цитохрому Р-450 (пиридины — изоникотинамид, 3-оксипиридин, метирапон), некоторые субстраты цитохрома Р-450, образующие, по всей вероятности, продукты гидроксилирования — антиоксиданты, а также индукторы синтеза цитохрома Р-450 (например, фенобарбитал).
Можно ли предположить, что перечисленные выше причины снижения содержания цитохрома Р-450 в гепатоцитах являются следствием активации процесса ПОЛ? В литературе есть единичные указания на то, что деградация цитохрома Р-450 в клетках печени коррелирует с образованием продуктов ПОЛ. Кроме того, из исследований, проведенных на изолированных полиферментных системах оксигеназ со смешанной функцией микросомальной фракции печени, следует, что в механизмах деградации цитохрома Р-450 ПОЛ, скорее всего, служит ускоряющим фактором. Известно, что само ПОЛ в микросомах способно лишь вызывать конверсию цитохрома Р-450 в неактивную форму цитохрома Р-420. Это означает, что наряду с процессами ПОЛ в условиях in vivo в деградации цитохрома Р-450 участвуют и другие механизмы, например протеолитическое разрушение цитохрома Р-450.
Из многочисленных опытов видно, что процесс ПОЛ и реакции протеолиза цитохрома Р-450 могут выступать в качестве двух взаимоусиливающих процессов, обеспечивающих в совокупности исключительно высокую активность разборки энзима. Кроме этого, в условиях образования перекисей липидов мембранносвязанные ферменты могут инактивироваться благодаря потери их гидрофобного окружения. При этом становится возможной атака SH-групп, групп гема окисляющими агентами.
Важным механизмом инактивации ферментов, в том числе цитохрома Р-450, может быть способность МДА и, возможно, других продуктов ПОЛ «сшивать» белки. Степень инактивации НАДФН-цитохром Р-450 редуктазной системы в микросомах во времени коррелирует с образованием МДА. В изолированных гепатоцитах, где скорость накопления МДА может быть существенна, такой механизм оказывается важным и частично объясняет изменения в НАДФН-цитохром Р-450 редуктазной активности.
Исходя из изложенного выше можно предполагать, что деградация цитохрома Р-450 обусловлена накоплением в гепатоцитах продуктов ПОЛ. Если в процессе инкубации суспензии гепатоцитов происходит спонтанное накопление МДА, то этот процесс обусловливает спонтанную деструкцию цитохрома Р-450 в изолированных клетках печени с высоким коэффициентом обратной корреляции.
В случае инкубации гепатоцитов в среде, содержащей систему инициирования ПОЛ, такая корреляция сохраняется, но в присутствии этой системы накопление МДА происходит со скоростью, приблизительно в 25 раз большей, чем в отсутствие инициаторов.
Обращает на себя внимание также более низкая скорость спонтанной деградации цитохрома Р-450 в гепатоцитах по сравнению с деградацией при индуцированном ПОЛ, и в то же время значительно менее интенсивное накопление продуктов ПОЛ. Тот факт, что при индуцированном ПОЛ в суспензии гепатоцитов резко интенсифицируется накопление МДА (в 25 раз выше по сравнению со спонтанным ПОЛ), но деструкция цитохрома Р-450 не увеличивается столь значительно (всего в 2 раза), говорит в пользу триггерного механизма ПОЛ в разборке цитохрома Р-450. Не вся мощность процесса ПОЛ используется в этом случае.
С другой стороны спонтанно развивающаяся индукция ПОЛ в гепатоцитах в процессе их инкубации не обязательно связана с НАДФН-зависимой его инициацией в эндоплазматическом ретикулуме клеток, как это имеет место в присутствии Fe+2 — АДФ + НАДФН.
Таким образом, несмотря на то что в такой сложной системе, как клетка, иногда трудно оценить полный вклад того или иного процесса в рассматриваемое явление, наличие зависимой от индукции ПОЛ деградации цитохрома Р-450 в гепатоцитах устанавливается экспериментально.
Антиоксиданты как стабилизаторы цитохрома Р-450 в гепатоцитах
Дополнительные доказательства связи деградации цитохрома Р-450 главным образом с активацией ПОЛ системой Fe2+— АДФ + НАДФН получены при исследовании действия ингибиторов свободнорадикального окисления липидов на деструкцию цитохрома Р-450 в изолированных гепатоцитах крысы.
В качестве возможного стабилизатора цитохрома Р-450 использовали широко применяемый антиоксидант жирорастворимый фенол 4-метил-2,6-дитретбутилфенол (ионол) в концентрации 10-4М. При инкубации гепатоцитов в присутствии ионола накопления МДА в течение 60 минут не происходило ни в случае индукции ПОЛ системой Fe2+ — АДФ + НАДФН, ни при отсутствии этой системы, а содержание цитохрома Р-450 оставалось на первоначальном уровне. Другой фенол — антиоксидант 1,2,3-триоксибензол (пирогаллол) в концентрации 10-4М также способствовал ингибированию накопления МДА в суспензии гепатоцитов и стабилизации цитохрома Р-450 в них, однако он обладал менее выраженным стабилизирующим действием, чем ионол.
Различие в действии двух веществ можно объяснить следующим образом. Ионол обладает отличными от пирогаллола стереоэлектронными свойствами, которые важны для проявления антиоксидантных свойств фенолов. Он имеет алкильные группы во 2-, 4-, 6-м положениях ароматического кольца (у пирогаллола такие группы отсутствуют), экранирующие феноксил, что и обусловливает его более сильные антиокислительные свойства, способствующие более выраженной стабилизации цитохрома Р-450 в гепатоцитах.
Кроме того, ионол гидрофобен и способен проникать в биологические мембраны, становясь ловушкой для алкильных радикалов. В отличие от этого пирогаллол является гидрофильным фенолом, способным перехватывать преимущественно перекисные радикалы липидов, вышедшие из мембраны.
Мы использовали также в качестве возможного стабилизатора цитохрома Р-450 2-этил-6-метил-3-оксипиридин (ОП-6) в концентрации 10-4М. Известно, что пиридины, в частности 3-оксипиридин, обладают стабилизирующим действием на цитохром Р-450 в культуре гепатоцитов за счет взаимодействия с цитохромом. Мы обнаружили стабилизирующий эффект ОП-6 на цитохром Р-450 в суспензии гепатоцитов, который совпадал с ингибирующим действием этого вещества на накопление МДА. Следовательно, стабилизирующее действие пиридинов на цитохром Р-450 может быть обусловлено не только их способностью взаимодействовать с цитохромом, но и их антиоксидантным свойством. Следует отметить, однако, что антиоксидантные свойства УОП-6 выражены слабее, чем у исследованного пирогаллола, ввиду достаточно высокой гидрофильности П-6. Надо сказать, что и 3-оксипиридин, как показано в работе Теина с соавторами, гораздо слабее стабилизировал цитохром Р-450 в культуре гепатоцитов чем, например, другой пиридин — метирапон, хотя он хорошо связывался с цитохромом.
Вероятно, стабильность цитохрома Р-450 в гепатоцитах при действии на них пиридинов зависит как от способности этих веществ взаимодействовать с цитохромом, так и от их антиоксидантных свойств.
