Роль восстановленного глутатиона при индукции ПОЛ в гепатоцитах

Защитные системы гепатоцитов от процесса ПОЛ

Из большинства работ, посвященных изучению токсичности различных веществ на модели изолированных гепатоцитов либо культуры этих клеток, следует, что повреждающее действие ве­ществ связано с изменениями в метаболизме глутатиона. Это и неудивительно. Восстановленный глутатион GSH — неотъемлемый компонент ре­акций, катализируемых глутатионпероксидазой (ГПО). Субстрата­ми этого фермента являются первичные молекулярные продукты ПОЛ — гидроперекиси ненасыщенных жирных кислот.

Если в культуре гепатоцитов имеет место снижение содержания GSH во времени, то с большой степенью достоверности можно го­ворить об интенсификации ПОЛ, вызванной тем или иным факто­ром. Это взаимоотношение прослежено в работе Ананди с соавторами. В ней показано, что при индукции ПОЛ хлорамином-Т в изолированных гепатоцитах происходит падение количества GSH. Это ведет в конечном счете к лизису клеток — явлению, ко­торое уже рассматривалось в более ранней работе Хегберга и Кристоферсона. Токсическое действие гидроперекиси кумола, диэтилмалеата и парацетамина на гепатоциты не обязательно со­провождается окислением GSH и накоплением МДА.

Исследования Хегберга с соавторами показали, что в за­висимости от природы индуктора ПОЛ способность GSH участво­вать в этом процессе может проявляться по-разному.

Индукция ПОЛ в изолированных гепатоцитах комплексом Fe⁺³ — АДФ (наиболее эффективная концентрация 187мкМ) и гидроперекисью кумола уже в первые 10 минут инкубации вызывала снижение содержания GSH и нарастание GSSG. При этом ГПК оказалась более сильным индуктором, чем Fe³⁺ — АДФ. ГПК в концентрации 150мкМ, когда скорость индукции ПОЛ еще мала, вызывала заметное снижение содержания GSH и образование GSSG в гепатоцитах уже в первые 5 минут инкубации. Однако на 20-й минуте снова преобладала восстановленная форма глутаткона GSH. ГПК в данном случае, по-видимому, под­вергалась воздействию ГПО, и в этой реакции участвовал восстановленный глутатион. Скорость реакции достаточно высока, чтобы уже через 5мин ГПК в гепатоцитах была превращена системой GSH+ГПО в оксикислоту и расходование GSH прекратилось.

При более высоких концентрациях (до 300мкМ и выше) ГПК эффективно индуцировала ПОЛ в гепатоцитах, и снижение содер­жания GSH происходило с большей скоростью, чем при действии на гепатоциты ГПК в концентрации 150мкМ. Это происходило потому, что ГПК в концентрациях, превышающих 150мкМ, подвергается гомолитическому распаду на цитохром Р-450. Образующиеся при этом активные радикальные интермедиаты индуцируют цепные реакции окисления липидов в клетках печени, по-видимому, прежде всего ацильных остатков фосфолипидов мембран эндоплазматического ретикулума, где локализована ферментная система монооксигеназ со смешанной функцией, терминальным компонентом которой яв­ляется цитохром Р-450.

В некоторых случаях не ПОЛ вызывает снижение содержания GSH в клетках печени, а наоборот, развитие ПОЛ в гепатоцитах наступает вследствие дефицита GSH, вызванного воздействием токсиканта. Подобную картину наблюдали Экстрем и Хегберг, когда исследовали действие хлороформа на свеже­выделенные гепатоциты крыс. В течение первого часа инкубации происходило снижение содержания GSH в клетках, что было следствием активного метаболизма СНСl₃. В гепатоцитах, выде­ленных из печени крыс, индуцированных фенобарбиталом, интен­сивность метаболизма СНСl₃ и интенсивность падения содержания GSH были значительно выше, чем в гепатоцитах из неиндуцированных фенобарбиталом крыс. Взаимодействие продук­тов метаболизма СНСl₃ (образование этих продуктов сходно с образованием продуктов метаболизма ССl₄) с белками гепатоци­тов, в том числе ферментами, ответственными за синтез GSH в клетках, явилось причиной снижения содержания GSH в клетках.

Радикальные продукты метаболизма СНСl₃ менее активны, не­жели продукты метаболизма ССl₄. Поэтому они не могут высту­пать инициаторами свободнорадикального окисления липидов: за­щитный антиоксидантный барьер непреодолим для них. Белковые компоненты клеток в меньшей степени, нежели липиды, защищены от атаки свободными радикалами, которые способны «сшивать» белки.

Снижение уровня GSH в гепатоцитах через 1ч их инкубации с СНСl₃ вызывало развитие процесса ПОЛ (накопление МДА). Одновременно нарушалась проницаемость плазматической мембраны гепатоцитов и начинался лизис клеток. Парацетамол, субстрат цитохрома Р-450, предварительно добавленный в суспензию гепатоцитов, снижал скорость образования МДА и предотвращал лизис клеток. Таким образом, токсическое действие СНСl₃, на гепатоциты проходит в две фазы:

1. про­дукты метаболизма СНСl₃ изменяют условия обмена GSH, что ведет к снижению его уровня в клетках;
   
   
2. развивающееся в связи с этим ПОЛ ведет к деструкции клеток.

В некоторых работах не было отмечено связи между актива­цией ПОЛ в гепатоцитах и потерей ими восстановленного глутатиона. Иногда процесс ПОЛ вызывал не снижение уровня GSH в культуре клеток печени, нагруженных комплексом Fe-нитрилтриацетат, а его возрастание.

Таким образом, изменение содержания восстановленного глутатиона в гепатоцитах, даже если при этом не регистрируются продукты ПОЛ, позволяет говорить об интенсификации процесса ПОЛ, тем более, если при этом наблюдается повреждение клеток печени.

Помимо глутатионпероксидазной защитной системы в клетках печени существуют другие ферментные системы, также обезвре­живающие эти клетки от действия активных форм кислорода, уча­ствующих в инициации ПОЛ. К таким системам относятся ферменты супероксиддисмутаза и каталаза, при аддитивном действии которых О₂ и Н₂О₂ обезвреживаются.

Эти ферментные системы в различных клетках играют центральную роль в регуляции ПОЛ на стадии инициирования. Мощ­ность этих систем в физиологических условиях достаточно высока. Но для обеспечения надежности защиты при развитии процессов ПОЛ в клетке существуют также и неферментативные системы: ловушки ОН-радикалов, алкильных и алкоксильных радикалов (антиоксиданты; альфа-токоферол, витамин С, стероидные гормоны).

Другая возможность антиоксидантной защиты состоит в уда­лении из гидрофобной фазы мембран ионов металлов переменной валентности с помощью эндогенных хелаторов — органических кислот, гистидина и др.

Кроме этого, в защите от действия продуктов ПОЛ, по-видимому, важна роль фермента фосфолипазы А₂, способной отщеплять модифицированные полиеновые жирнокислотные цепи фосфолипи­дов. Гидрофильность этих цепей повышается благодаря появлению в них гидроперекисных группировок, что облегчает включение ацильных остатков в дальнейший окислительный метаболизм.

Важным неспецифическим фактором регуляции ПОЛ, дейст­вующим практически на всех стадиях процесса, является структур­ный антиокислительный эффект, под которым понимают комплекс свойств биомембран, ограничивающий доступ субстратов ПОЛ — ацильных непредельных остатков фосфолипидов для кислорода и его активных форм, катализаторов ПОЛ, радикальных интерме­диатов ПОЛ.

И, наконец, как мы уже рассматривали, ГПО способна превра­щать гидроперекиси жирных кислот в оксикислоты; эта реакция идет в присутствии восстановленного глутатиона, в ходе которой происходит его окисление.

Если в гепатоцитах надежность всех антиокислительных систем высока, то, по-видимому, развитие процессов ПОЛ будет сильно ограничено. Естественно, что это верно только тогда, когда гепа­тоциты находятся в адекватных условиях инкубации и метаболи­ческие характеристики, в том числе и системы защиты клеток от процессов свободнорадикального окисления липидов, соответству­ют нативным критериям.

Кинетика спонтанного ПОЛ в гепатоцитах при их инкубации в первые часы после выделения может быть критерием надежно­сти этих систем. Методическая тщательность выделения клеток печени играет положительную роль в получении высоких характеристик, касающихся антиокислительной способности гепатоци­тов при их инкубации. Вероятно, разные авторы получают доста­точно противоречивые данные о роли ПОЛ в токсическом эффекте различных веществ на клетки печени именно в силу того, что в каждом конкретном случае в гепатоцитах могут быть иные соот­ношения между факторами, способствующими активации ПОЛ и препятствующими развитию этого процесса. Немаловажное значе­ние имеет также то, на каком этапе развития ПОЛ — инициации, пропагации или образования вторичных продуктов — нарушается надежность систем защиты в клетке.

При действии различных токсикантов — индукторов ПОЛ — на клетки печени можно резко нарушить надежность антиоксидантных систем защиты на разных этапах развития ПОЛ.

Рассмотрим теперь подробнее возможные последствия индук­ции ПОЛ в гепатоцитах.

Повреждения гепатоцитов, вызванные индукцией ПОЛ

Развитие процесса ПОЛ независимо от того, какие индукторы вызвали этот процесс, может вести к деструктивным изменениям в клетках. Это происходит потому, что в результате свободнора­дикального окисления липидов в клетках накапливаются различные продукты, оказывающие отрицательное действие на внутри­клеточные компоненты клеток: инактивация и солюбилизация мембранных ферментов, нарушение белок-липидных взаимодействий в мембранах, образование межмолекулярных сшивок. Такие повреждающие воздействия ПОЛ на клетку проявляются, как правило, при нарушении регуляции этого процесса, т.е. при развитии различных патологий. Повреждение кле­ток в результате развития процесса ПОЛ может при прочих равных условиях ускорять этот процесс.

Гепатоциты являются хорошей моделью для исследования ме­ханизмов таких повреждений. Активация ПОЛ связана с ультраструктурными изменениями в гепатоцитах, с уменьшением активности глюкозо-6-фосфатазы, которая влияет на се­креторные функции этих клеток.

Исследования индукции ПОЛ в гепатоцитах позволяют отве­тить на вопросы, связанные не только с первичными явлениями протекания процесса ПОЛ, но и с более глубокими изменениями в клетках печени при развитии этого процесса. Как мы уже отме­чали, при индукции ПОЛ ССl₄ или другими индукторами в некоторых случаях происходит увеличение количества поврежденных клеток, а при определенных условиях повреждение гепатоцитов вызывает интенсификацию ПОЛ.

Костеру с соавторами удалось установить на микро­сомальной фракции печени и гепатоцитах, что при индукции НАДФН-зависимого ПОЛ в микросомах и индукции ПОЛ Fe³⁺ — АДФ и ГПК в гепатоцитах с течением времени образуются хро­мопротеиды, обладающие характерной флуоресценцией. Применяя специфические ингибиторы образования ОН-радикала — тиомочевину и каталазу, Костер с соавторами показали, что инициирую­щим радикалом в процессе ПОЛ как в микросомах, так и в изо­лированных гепатоцитах является ОН-радикал: образование вто­ричных продуктов ПОЛ (МДА) в гепатоцитах коррелирует с на­коплением хромопротеидов и эффективно ингибируется каталазой и тиомочевиной.

Возможность индуцировать НАДФН-зависимое ПОЛ в гепа­тоцитах системой Fe³⁺/Fe²⁺ — АДФ в присутствии НАДФН и сня­тие таким образом антиоксидантной «блокады», как делают некоторые исследователи, приводит к тому, что развитие процесса ПОЛ постепенно выходит из-под контроля регуляторных систем защиты. При использовании других способов индукции ПОЛ в гепатоцитах контроль со стороны этих регуляторных систем также начинает ослабевать. Ввиду этих причин в «стрессированных» гепатоцитах и происходят изменения, ведущие к накоплению продуктов ПОЛ, а вследствие этого и различным видам повреждений в клетках печени как на молекулярном, так и клеточном уровнях.

Предотвращать эти вредные для клетки воздействия, происходящие в результате активации процесса ПОЛ в гепатоците, возможно. Весьма эффективным способом является увеличение мощности антиоксидантной системы посредством внесения в суспензию или культуру гепатоцитов различных антиоксидантов.