Перекисное окисление липидов в гепатоцитах

Общие принципы генерации перекисей липидов в биологических системах

Перекисное окисление мембранных фосфолипидов играет важную роль в жизнедеятельности организма. С одной стороны, оно принимает участие в поддержании нормальной физиологической активности клетки, являясь необходимым, например, для синтеза простагландинов, лейкотриенов. Но в то же время оно может приводить к повреждению мембран, выражающемуся в нарушении белок-липидных и липид-липидных взаимодействий, ингибированию активности ферментов, изменению избирательности проницаемости мембран для ионов и т.д.

Существенную роль в инициации перекисного окисления липидов (ПОЛ) в клетке играют активные формы кислорода. Как сейчас установлено, ОН-радикал в отличие от О₂ и Н₂О₂ является высокоактивным радикалом и легко может окислять органические субстраты, в том числе ненасыщенные жирные ацилы мембранных фосфолипидов.

В результате такой радикальной инициации образуется активный алкильный радикал R, способный продолжать цепь свободнорадикального окисления липидов.

R + О₂ = RO₂

RO₂ + RH = ROOH + R и т.д.

Это положение в настоящее время экспериментально доказано благодаря использованию различных методов регистрации образования активных форм кислорода и продуктов ПОЛ, исследованию ингибирования их образования специфическими антиоксидантами, акцепторами и ловушками, в том числе спиновыми. Использование последних позволяет прямо зарегистрировать наличие тех или иных свободнорадикальных состояний молекул (алкильные и алкоксильные радикалы, О₂ и ОН).

Такого рода исследования проводятся в основном в химических системах или на мембранных моделях, как, например, микросомальная модель. Они не только не исключают, но и предполагают возможность изучения механизмов активации молекулы кислорода в процессах ПОЛ и на более сложноорганизованной клеточной модели, например на гепатоците, широко используемом для изучения метаболических взаимоотношений, связанных в том числе и с ПОЛ.

Это и понятно. В эндоплазматической сети этих клеток локализована электронтранспортная цепь, включающая в себя систему монооксигеназ со смешанной функцией. Она осуществляет детоксикацию ксенобиотиков на цитохроме Р-450 — терминальном участке этой системы, где в результате образования комплекса фермент — субстрат — кислород происходит гидроксилирование субстрата.

В то же время в отсутствие субстратов гидроксилирования компоненты этой системы обладают способностью осуществлять НАДФН-зависимое ПОЛ. В его инициации существенная роль отводится НАДФН-цитохром Р-450 редуктазе. Последняя катализирует ферментную генерацию что может приводить к образованию ОН-радикала и его взаимодействию с жирными ацилами фосфолипидов мембран эндоплазматического ретикулума, а следовательно, и к свободнорадикальному окислению этих молекул, т.е. к индукции ПОЛ. В изолированных гепатоцитах также наблюдали генерацию супер оксид-аниона.

По-видимому, эти процессы могут играть важную роль в качестве факторов, повреждающих клетку. Поэтому, чтобы предотвратить возможные вредные последствия ПОЛ для клетки и организма в целом, необходимо оценивать интенсивность этого процесса в гепатоцитах.

Методы исследования процесса ПОЛ в гепатоцитах

Обнаружение продуктов ПОЛ в гепатоцитах и правомочность использования различных традиционных методов регистрации этих продуктов в интактной клетке представляются очень важной проблемой. Непосредственно этому вопросу посвящено достаточно много работ. В ряде из них была сделана попытка использовать рутинные методы прямого определения продуктов ПОЛ (свободные радикалы — с помощью хемилюминесценции; диеновые конъюгаты и вторичный продукт ПОЛ — МДА — спектрофотометрически; флуоресцирующие пигменты — флуориметрически). Наряду с ними используются сравнительно новые хроматографические методы определения конечных газообразных продуктов ПОЛ — летучих углеводородов (этана, пентана).

Так, в работе Смита с соавторами найдена корреляция между накоплением вторичного продукта ПОЛ — малонового диальдегида — и образованием конечных продуктов — этана, пентана, а также флуоресцентных и хемилюминесцентных продуктов ПОЛ. Поэтому, несмотря на то что в клетках МДА может метаболизироваться митохондриями и реагировать с другими внутриклеточными компонентами, относительную скорость ПОЛ в гепатоцитах разумно определять по накоплению МДА, оцененному по взаимодействию с ним 2-тиобарбитуровой кислоты. Это положение подтверждает также работа Рилея с соавторами, в которой показано, что токсическое действие CCI₄, связанное с интенсификацией ПОЛ в гепатоцитах, вызывает появление диеновых конъюгатов, что коррелирует с образованием МДА.

Наиболее специфичным для определения продуктов ПОЛ является метод регистрации выделения этана. С его помощью, так же как и методом хемилюминесценции, можно обнаружить первичное токсическое действие чужеродных для клетки веществ.

Способы и механизмы инициации ПОЛ в гепатоцитах

Рассмотрению механизмов индукции и протекания процесса ПОЛ в гепатоцитах посвящено достаточно большое количество работ. Ведущими в этой области являются исследования группы Хегберга и Оррениуса.

Индукцию ПОЛ в гепатоцитах, как правило, осуществляют комплексами железа АДФ — Fe²⁺/Fe³⁺, Fe⁺²-нитрилтриацетат или органическими гидроперекисями кумола (ГПК) и трет-бутила. Возможна также индукция ПОЛ галогеналканами (ССl₄, CClBr₂), хлороформом (СНСl₂). Установлено, что эти агенты хорошо проникают в клетки и способны с достаточной эффективностью инициировать ПОЛ. При этом обнаруживается интенсивное образование промежуточных продуктов ПОЛ, прежде всего диеновых конъюгатов и МДА. С увеличением концентрации индукторов скорость накопления МДА увеличивается. Поглощение кислорода в изолированных гепатоцитах в присутствии Fe²⁺/АДФ также увеличивается, а содержание GSH уменьшается. Каковы же механизмы индукцин ПОЛ в гепатоцитах?

Система Fe²⁺/Fe³⁺— АДФ + НАДФН индуцирует ферментное НАДФН-зависимое ПОЛ в цепи монооксигеназ микросомальной фракции клеток печени, когда, согласно Лею, Пиетту и Свинджену с соавторами, НАДФН-цитохром с-редуктаза в комбинации с Fe²⁺— АДФ может катализировать образование гидроперекисей липидов (ROOH).

Ферментативным этапом такой инициации перекисей липидов является только стадия активации кислорода на НАДФН-цитохром с-редуктазе: через флавин этого фермента — флавопротеида — с НАДФН «стекает» электрон на Fe³⁺—АДФ (или другой комплекс трехвалентного железа), который восстанавливается до Fe²⁺— АДФ. Электрон с Fe²⁺ восстанавливает молекулярный кислород до анион-супероксида (O₂). Далее осуществляется неферментативная цепь превращений с участием ионов Fe²⁺ и Fe³⁺, а также активных форм кислорода и мембранных липидов гепатоцитов, ведущая к генерации ОН-радикалов и инициации ПОЛ. Развитие процесса ПОЛ идет по свободнорадикальному цепному механизму, и в клетках предусмотрен ряд защитных систем, предотвращающих это развитие.

Другой возможный механизм активации ПОЛ в гепатоцитах (пропагация) осуществляется с помощью органических гидроперекисей, которые, в частности, могут быть продуктами окисления гидрофобных субстратов системой монооксигеназ. Гидроперекиси липидов, образовавшиеся в результате взаимодействия ОН-радикалов с жирными ацилами мембранных фосфолипидов, как уже говорилось, также могут участвовать в стадии пропагации.

В реакции пропагации, помимо гидроперекиси липида (органической гидроперекиси, например гидроперекиси кумола), участвуют комплексированные ионы Fe²⁺/Fe³⁺ или цитохром Р-450. Они осуществляют гомолитический распад гидроперекисей с образованием интермедиатов радикальной природы, участвующих в продолжении цепи окисления липидов клеток печени.

И, наконец, остановимся еще на одном механизме индукции ПОЛ в гепатоцитах, в котором индуктором является классический гепатотоксин CCl₄. Известно достаточное количество примеров токсичности этого вещества на клетки печени, проявляющейся, в частности, в активации ПОЛ.

Механизм активации ПОЛ при действии ССl₄ на клетки печени был понят довольно давно. В середине 60-70-х годов в ряде работ было продемонстрировано, что ССl₄ является субстратом цитохрома Р-450 в гепатоцитах, на котором происходит образование ССl₃ — продукта радикальной природы. Эти радикалы обладают высокой реакционной активностью и способны эффективно взаимодействовать как с белками, так и с липидами, инициируя свободнорадикальное окисление. Было замечено также, что в гепатоцитах, выделенных из печени животных, предварительно индуцированных фенобарбиталом, в результате увеличения содержания цитохрома Р-450, происходит более интенсивный метаболизм ССl₄ по сравнению с гепатоцитами из печени неиндуцированных животных и соответственно более интенсивная индукция ПОЛ. При этом наблюдали, что в процессе инкубации гепатоцитов с ССl₄ содержание цитохрома Р-450 в них падает (на 65% через 30мин инкубации), а скорость накопления МДА увеличивается параллельно этому.

Таким образом, пути активации ПОЛ в гепатоцитах не однозначны и в зависимости от того, каким путем осуществляется эта активация, проявляются те или иные токсические свойства веществ-индукторов ПОЛ или продуктов ПОЛ. Поэтому в некоторых случаях бывает важно прослеживать взаимосвязь процессов ПОЛ и действия различных токсикантов на клетку.