Для определения интенсивности процессов метаболизма гидроперекисей в арсенале исследователей имеется целый ряд различных методов.
К наиболее широко применяемым способам качественной и количественной регистрации H2O2 относится определение равновесий концентрации комплекса каталазы с перекисью водорода — так называемый комплекс 1. Этот метод, разработанный Ошино с соавторами, основан на том факте, что равновесная концентрация комплекса 1 зависит от общего количества каталазы, скорости генерации перекиси и концентрации донора водорода. Регистрируя изменение спектра поглощения в области λ = 630-660нм (двухволновая спектрофотометрия) при добавлении донора водорода, можно рассчитать скорость образования H2O2. В качестве донора водорода предпочтительнее использовать метанол, так как он не является субстратом для НАД-зависимых дегидрогеназ. Метод имеет широкую область применения, в том числе используется и для суспензии изолированных клеток печени. Однако необходимо отметить, что регистрация комплекса 1 позволяет наблюдать за количественными изменениями только той перекиси, которая поступает в компартменты, содержащие каталазу, и не учитывает катаболизма H2O2 в других системах.
Высокое содержание каталазы в клетках печени, а также ее способность разлагать перекись водорода с выделением кислорода делает возможным использовать полярографический метод для оценки активности различных путей утилизации H2O2. Добавляя к клеткам печени экзогенную перекись водорода и учитывая, что на 2 моля H2O2 при полном разложении ее по каталазному пути выделяется 1 моль кислорода, можно оценить интенсивность других перекисьутилизирующих систем. Уникальную способность каталазы разлагать перекись водорода до О3 и Н2О можно использовать для оценки интенсивности ее выделения во внеклеточную среду при добавлении в среду инкубации гепатоцитов экзогенного фермента либо его ингибиторов.
Катаболизм гидроперекисей цитозольного и митохондриального пула можно изучать по скорости окисления GSH и/или выделения из клеток GSSG, так как эти метаболиты входят в систему взаимодействия пероксидаз с гидроперекисями. В этом случае необходимо иметь в виду, что основная часть окисленного глутатиона восстанавливается под действием НАДФН-глутатионредуктазы. Следовательно, не всегда скорость выделения окисленного глутатиона соответствует истинной скорости разложения гидроперекисей. Несмотря на это, метод достаточно информативен и широко распространен в практике исследования метаболизма гидроперекисей в различных клетках, в том числе и в гепатоцитах. Наличие сопряжения глутатионпероксидазной и НАДФН-зависимой глутатионредуктазной активности может служить источником дополнительной информации о процессах метаболизма гидроперекисей в гепатоцитах. В этом случае изменение скорости окисления пиридиннуклеотида является отражением скорости пероксидазного пути утилизации гидроперекиси.
В связи с тем что продукты промежуточного метаболизма кислорода недовосстановлены, представляет интерес метод оценки интенсивности перекисьобразования и с использованием флуоресцентных доноров водорода для восстановления гидроперекисей. К числу таких соединений относится скополетин (7-гидрокси-6- метоксикумарин). Это соединение является донором водорода для пероксидазы хрена при восстановлении перекиси водорода
При этом окисление скополетина сопровождается потерей способности флуоресцировать.
Так как стехиометрия процесса равна 1:1, а интенсивность флуоресценции прямо пропорциональна концентрации восстановленного скополетина, то по уменьшению флуоресценции в единицу времени можно рассчитать скорость его окисления и, следовательно, скорость генерации гидроперекиси. Согласно данным литературы, метод использовался как применительно к субклеточным фракциям, так и при работе с клетками лимфоидного ряда, стимуляция которых соответствующими агентами приводит к интенсивному выделению H2O2 в экстрацеллюлярную среду. В обоих случаях производилась оценка скорости генерации той перекиси, которая восстанавливалась скополетином в присутствии экзогенно добавляемой пероксидазы хрена.
Однако на изолированных клетках было отмечено спонтанное окисление скополетина, что объяснялось участием в этом процессе эндогенной миелопероксидазы. При оценке метаболизма гидроперекисей в суспензии гепатоцитов с помощью данного метода нами также был отмечен факт эндогенного окисления флуоресцентного донора водорода. В результате экспериментальной проверки было установлено, что этот процесс объясняется окислением скополетина при восстановлении гидроперекисей эндогенными пероксидазами. Проникая внутрь клетки, скополетин включается в катаболизм гидроперекисей в системе эндоплазматических пероксидаз, интенсивность работы которых зависит от активности процессов, генерирующих перекись. К сожалению, поскольку глутатионпероксидаза способна восстанавливать как Н2О2, так и органические гидроперекиси, метод не позволяет оценить активность генерации отдельных метаболитов кислорода и является интегральным показателем состояния перекисьобразующих систем.
Достоинством данного метода является возможность непрерывной и одновременной регистрации активности пероксидазной реакции и скорости утилизации кислорода, что достигается применением комбинированной флуоресцентно-полярографической установки. Поскольку окисления скополетина биологическим объектом в отсутствии кислорода не наблюдается (нет образования кислородсодержащих перекисных частиц), регистрация сразу двух процессов позволяет ввести дополнительный показатель перекисьобразования — долю О2, используемую для окисления скополетина. По этому показателю можно опосредованно, через активность катаболизма перекисей, судить о потоке кислорода, идущего на генерацию гидроперекисей. Таким образом, запись кинетики флуоресценции скополетина в присутствии биологического объекта позволяет вести мониторинг метаболизма гидроперекисей.
Для изучения метаболизма свободнорадикальных частиц, в частности супероксидного аниона, используют способность О2 восстанавливать ряд соединений. При этом меняются их спектральные характеристики. Например, восстановление супероксидом цитохрома с приводит к уменьшению поглощения в области λ = 550-540нм (двухволновая спектрофотометрия). Поскольку часть супероксидного аниона может выходить за пределы клетки, этот метод применим и для суспензии клеток печени. Особенно эффективен он при использовании искусственных дериватов цитохрома с — ацетилированной или сукцинатной его форм, поскольку в таком виде он малореактивен — с другими восстанавливающими агентами, например флавинзависимыми цитохром с-редуктазами.
При измерении в биологических системах синглетного кислорода определенные трудности возникают в связи с тем, что период полураспада этой частицы очень мал: в водных растворах он равен примерно 2мкс. Переходя в основное, триплетное состояние, отдает энергию в виде кванта света:
1О2 + 1О2 = 23О2 + hv.
Регистрируя это свечение и проводя спектральный анализ хемилюминесценции, можно идентифицировать синглетный кислород. Пики излучения для О2 находятся в области λ = 570-580; 634; 703; 1070 и 1269нм. Прямая фотосенсибилизированная хемилюминесценция синглетного кислорода в растворе ССl4 впервые была зарегистрирована А.А. Красновским. В биологических системах, в том числе и в гепатоцитах, этот метод нужно применять с осторожностью, так как хемилюминесценция не всегда является следствием исключительно только распада синглетного кислорода. Кроме того, в клетке могут присутствовать «тушители» активности 1О2: бета-каротин, гистидин, жирные кислоты.
Для оценки вклада гидроксильного радикала в процессы жизнедеятельности живых объектов широкое применение имеют различного рода «ловушки» этой частицы: маннитол, бензоат, дериваты мочевины и др. Применение в биологических исследованиях соединений, способных специфически удалять из системы те или иные кислородреактивные частицы, является довольно широко распространенным приемом.
Несмотря на интенсивное изучение механизмов перекисьобразования в живых системах, многие аспекты до сих пор остаются открытыми. В настоящее время нет общего теоретического обоснования физиологической значимости процесса поэтапного восстановления кислорода и образующихся при этом частиц. В значительной степени это связано с трудностями методического характера. Поэтому идет постоянный поиск новых методов и объектов, позволяющих более глубоко и детально проникать в сущность механизмов образования и метаболизма перекисей. Одной из достаточно адекватных моделей для изучения такого рода процессов является ткань печени и, в частности, суспензия изолированных гепатоцитов.
