Свободнорадикальные кислородзависимые процессы в биологических системах
Помимо четырехэлектронного восстановления О2 в биологических системах возможны процессы, ведущие к образованию возбужденных и промежуточных по степени восстановленности состояний кислорода. Из них для реакций О2 с биологическими субстратами могут быть существенны следующие:
- образование синглетного (возбужденного) кислорода;
- последовательное одноэлектронное восстановление О2;
- комплексирование О2 с металлами переменной валентности.
Образование синглетного кислорода в клетках печени показано в работах Каденаса и соавторов, проведенных как на гомогенате, так и на изолированных гепатоцитах. Анализ полученных результатов позволил авторам сделать вывод, что генерация этой частицы для клеток печени является следствием процессов перекисного окисления липидов.
Помимо перехода в возбужденное состояние, молекула О2 может принять два дополнительных электрона. При этом образуется супероксидный анион (O2-) и пероксильный анион (O2-2).
Взаимодействие (дисмутация) двух молекул О2 приводит к образованию другого промежуточного продукта восстановления кислорода — перекиси водорода.
Хотя возможен процесс спонтанного протекания этой реакции, в клетках печени более вероятно энзиматическое диспропорционирование супероксидного аниона при участии специального фермента — супероксиддисмутазы (СОД).
Перекись водорода, принимая дополнительно два электрона, восстанавливается до воды. Большая реакционная способность супероксида и перекиси водорода делает возможным их взаимодействие между собой. Эта реакция, впервые описанная Хабером и Вейссом, протекает в присутствии ионов железа и приводит к образованию более токсичного, чем изначальные продукты соединения, гидроксильного радикала (ОН). Считается, что ОН является одним из наиболее вероятных активаторов перекисного окисления липидов. Имеются данные, что супероксидзависимое образование гидроксильного радикала реализуется в физиологических условиях in vivo.
В процесс свободнорадикальных превращений кислорода могут вовлекаться различные биологически важные молекулы: пиридиннуклеотиды, макроерги (АТФ, ГТФ и др.), лактоферрин и трансферрин и др. Таким образом, образование продуктов промежуточного восстановления кислорода в живых системах создает возможность взаимодействия их между собой и другими молекулами и ионами, появления новых токсичных продуктов и запуска патологических процессов типа перекисного окисления липидов.
Роль субклеточных органелл в процессах промежуточного восстановления кислорода
Продуцировать активированные формы кислорода способны практически все органы и ткани аэробных организмов. У крыс наибольший вклад в этот процесс вносит печень. На долю этого органа может приходиться до 75% всей перекиси водорода, генерированной in situ. Количество кислорода, связанного с образованием этого продукта в общем объеме клеточного дыхания, зависит от многих причин и может составлять 2-50%.
Генерация супероксидного радикала и перекиси водорода в различных компартментах клетки связана с работой соответствующих кислородпотребляющих реакций, имеющих, как правило, достаточно четкую компартментализацию.
Наиболее мощной системой, связанной с образованием гидроперекиси, являются пероксисомы. Эти органеллы имеют набор ферментов-оксидаз, которые восстанавливают кислород до Н2О2. К числу таких энзимов относятся уратоксидаза, гликолатоксидаза, оксидаза Д-аминокислот и ряд других. Кроме того, в пероксисомах возможен процесс окисления жирных кислот, также сопровождающийся выходом Н2О2. Вклад этих органелл в генерацию перекисей значительно увеличивается в присутствии соответствующих субстратов. Так, например, скорость образования Н2О2 пероксисомами перфузируемой печени в присутствии лактата и пирувата составляет 49 нмоль на г-1 в мин-1. При добавлении же гликолата или мочевой кислоты генерация перекиси увеличивается до 490 и 750 нмоль на г-1 в мин-1 соответственно. Аналогичные отношения показаны на суспензии изолированных гепатоцитов: в присутствии эндогенных субстратов скорость образования перекиси составляет примерно 130 нмоль на г-1 в мин-1; если же инкубация клеток проводится в присутствии гликолата, выход перекиси увеличивается на порядок.
Активация работы пероксисомальных оксидаз может быть достигнута и другим путем. Например, имеется целый ряд гиполипидемических соединений, введение которых в организм приводит к значительному увеличению количества пероксисом и активации их ферментов. Наиболее широко применяемым и хорошо изученным агентом такого рода является клофибрат (этил-р-хлорфеноксиизобутират). Добавление к культуре гепатоцитов 0,5мМ клофибрата приводит к увеличению уже через 72ч инкубации количества пероксисом и 20-кратному росту активности таких пероксисомальных ферментов, как пальмитоил СоА-оксидаза и карнитинацетилтрансфераза.
Генерация супероксидного аниона в эндоплазматическом ретикулуме связана с работой оксигеназ смешанной функции. Одним из участков образования О2 является цитохром Р-450. Известно, что в процессе гидроксилирования эндогенных и экзогенных субстратов образуется субстрат-ферментный комплекс цитохрома Р-450 с кислородом, который в результате внутримолекулярного переноса электронов находится в активированном состоянии. Часть кислорода может выходить из состава комплекса в форме О2 в цитоплазму. Кроме того, супероксид может образовываться на флавинзависимой НАДФН-цитохром Р-450 редуктазе. Поэтому стимуляция процессов микросомального окисления приводит к усилению выхода активированного кислорода. Так, например, в работе Тора и соавторов показано, что суспензия изолированных гепатоцитов, выделенных из печени крыс, обработанных фенобарбиталом, начинает генерировать О2 во внеклеточную среду при добавлении к клеткам субстрата микросомального окисления менадиона (2-метил-1,4-нафтохинон). Образование супероксида в данном случае связано с работой микросомальных НАДФН-зависимых флавоэнзимов, катализирующих, редокс-цикл менадиона с кислородом.
Основной потребитель внутриклеточного кислорода — митохондрии — также вносит значительный вклад в генерацию продуктов промежуточного его восстановления. Образование супероксидного аниона и перекиси водорода этими органеллами наблюдается в условиях высокой степени восстановленности переносчиков дыхательной цепи и связано с активностью участка, находящегося между ротенон- и антимицинчувствительными точками.
Наиболее вероятными компонентами, ответственными за этот процесс, считаются НАДН-дегидрогеназа и убихинон. Н2О2, генерируемая митохондриями, является скорее его вторичным продуктом, образованным в результате дисмутации супероксидного аниона. Однако не исключена возможность прямого двухэлектронного восстановления кислорода до перекиси водорода.
Образование перекисных частиц в митохондриях стимулируется различными факторами, в том числе переходом из состояния 3 в состояние 4 (по Чансу), действием протофоров и ионофоров в присутствии антимицина А, увеличением парциального давления кислорода. Максимальная активация перекисьобразования наблюдается в присутствии сукцината. Другие субстраты (малат, глутамат, октаноат) менее активны в этом отношении.
Цитозольные ферменты, такие, как ксантиноксидаза, алкогольоксидаза, также дают вклад в общую генерацию гидроперекисей клеткой, но доля их в этом процессе невелика.
Таким образом, реализация кислородзависимых реакций в клетке может приводить к генерации продуктов неполного восстановления кислорода. Интенсивность этого процесса зависит, в частности, от обеспечения соответствующих реакций субстратами. Для того чтобы оценить мощность процессов перекисьобразования в различных компартментах клетки печени, Боверис и соавторы провели сравнительный анализ скорости образования перекиси водорода изолированными субклеточными фракциями.
