Механизмы функционирования редокс-цепи, локализованной в эндоплазматическом ретикулуме клеток печени, исследовались долгое время на изолированной полиферментной системе микросом. Однако в последние годы произошла серьезная ревизия методических подходов в этом вопросе, основанная на том соображении, что получаемые результаты ни количественно, ни качественно в полной мере не отражают ситуацию, имеющую место in vivo. Действительно, имеются серьезные аргументы в пользу того, что функциональные аспекты биотрансформации ксенобиотиков могут и должны изучаться в условиях сохранения интегрированности внутриклеточных процессов и интактности клетки.
Так, например, процесс гомогенизации, сопровождающийся освобождением лизосомальных энзимов, вследствие деструкции мембранных компонентов и потери кофакторов может приводить к артефактным метаболическим изменениям, активации или ингибированию различных энзимов. В частности, показано, что функциональное состояние митохондрий в гомогенате резко изменено, в результате чего бифенил-2 и бифенил-4-гидроксилазная активности подавлены. Гомогенизация сопровождается нарушением компартментализации эндогенных ингибиторов, их высвобождением и выходом из клетки, а также изменением свойств фосфолипидного комплекса.
Последний играет существенную роль в связывании ксенобиотиков с цитохромом Р-450. Микросомальные ферменты монооксигеназной системы защищены липидным «барьером», и окислительному метаболизму субстратов этой системы обязательно предшествует этап проникновения их через липидный матрикс мембраны эндоплазматического ретикулума. Динамика мультифазного липидного компонента может модулировать конформацию цитохрома Р-450, влияя тем самым на биотрансформацию и определяя, по-видимому, связывание цитохрома Р-450 с субстратами с образованием спектров I и II типа, а также направление его действия в оксигеназных реакциях: либо как оксидаза, либо как пероксидаза. Изменение свойств разделительной липидной фазы может влиять на связывание цитохрома Р-450 с другими электронтранспортными системами, локализованными в мембранах эндоплазматического ретикулума на некотором расстоянии от последнего. Наконец, липиды, по-видимому, могут принимать участие в образовании текучего окружения ферментов, которое облегчает транспорт электронов от НАДФН к цитохрому P-450. Поэтому потеря контроля некоторых функций эндоплазматического ретикулума при его выделении может влиять на активность системы биотрансформации.
При работе с изолированными субклеточными системами концентрации кофакторов, используемые для инкубации, обычно не соответствуют их физиологическим уровням в клетке. Поэтому может идти непредвиденное образование метаболитов, не имеющее место in vivo. Примером является образование токсических продуктов в нитроредуктазных реакциях, когда используются очень высокие концентрации кофакторов. В интактной клетке промежуточные метаболиты, в том числе и токсические, могут связываться с белками или вступать в реакции конъюгации и выводиться из нее.
Следует учитывать также, что метаболизм одного вещества в целой клетке может быть связан с различными компартментами, в которых реализуются отдельные звенья целого процесса. Так, например, начальные этапы метаболизма этанола протекают в цитозоле, а промежуточные продукты окисляются в митохондриях. Сходная ситуация имеет место при метаболизировании антидепрессанта имипрамина. В эндоплазматическом ретикулуме происходит N-окисление, N-деметилирование и ароматическое гидроксилирование этого соединения. Промежуточный продукт имипрамин-N-оксид может быть восстановлен снова в имипрамин либо подвергнут N- деметилированию в цитозоле. Это N-деметилированное производное вступает в реакцию конъюгации. Примеры могут быть продолжены.
В интактной клетке в отличие от изолированных полиферментных систем сохраняется возможность взаимодействия различных субклеточных структур, например митохондрий и эндоплазматического ретикулума, благодаря чему осуществляется направленное регулирование процесса биотрансформации ксенобиотиков, обеспечивающее либо усиление, либо ослабление активности микросомального окисления. Естественно, что такое взаимодействие невозможно в изолированной микросомальной фракции.
Наконец, метаболизм ксенобиотиков в интактной клетке зависит от проницаемости клеточной мембраны и от характера поступления ксенобиотиков. Многие из них проникают через плазматическую мембрану путем простой диффузии. Наряду с этим имеются вещества, например метотрексат, накопление которых в клетке связано с активным транспортом.
Преимущества использования свежеизолированных гепатоцитов млекопитающих для изучения процессов биотрансформации состоят в возможности комплексного и последовательного изучения всех их стадий и звеньев, а именно: проницаемости клеток как для самого ксенобиотика, так и для его метаболитов, продуцируемых печенью и другими органами; взаимодействия между преконъюгацией и конъюгацией вещества; взаимодействия ксенобиотиков и их метаболитов с клеточными органеллами — высвобождения свободных и связанных метаболитов из клетки во внеклеточное пространство и т.д.
Использование интегрированных систем с сохраненной внутриклеточной структурой желательно и для изучения функциональных аспектов активности системы микросомального окисления. А это, в свою очередь, требует специального изучения свойств изолированных клеточных систем в интересующем направлении.
Свежеизолированные гепатоциты, полученные из печени взрослых животных и инкубируемые в виде суспензии, активно метаболизируют чужеродные соединения и сохраняют способность к биотрансформации веществ, сходную с перфузируемой печенью, печенью in situ, и существенно выше, чем в срезах.
К настоящему времени по этому вопросу накоплен обширный материал, основанный на испытании большого круга (несколько десятков) самых разнообразных веществ, свидетельствующий о том, что гепатоциты с успехом могут быть использованы для изучения различных реакций обеих стадий биотрансформации ксенобиотиков в условиях in vitro.
Среди изученных веществ можно назвать этилморфин, анилин, бензо(а)пирен, амидопирин, дифенилгидантоин, бензойную кислоту, фенол, бифенил, этоксикумарин, гексобарбитал, нафталин, хинин, антипирин, n-нитрофенол, n-нитроанизол и многие другие. Проведенные в этом направлении исследования показывают, что изолированные гепатоциты способны к реализации многих реакций I стадии биотрансформации — преконъюгации, как, например, ароматического гидроксилирования, N- и О-деметилирования, гидроксилазных реакций. Одновременно с этим в гепатоцитах осуществляется и II стадия биотрансформации ксенобиотиков — конъюгация с эндогенными кислотами и углеводами, а также реакции ацетилирования.
Метаболизирование субстратов I и II стадий биотрансформации гепатоцитами идет, как правило, с линейной скоростью, по крайней мере, в первые 30-60 минут.
Ответственными за метаболизм ксенобиотиков в суспензии гепатоцитов являются исключительно паренхиматозные клетки. В настоящее время точно установлено, что непаренхиматозные (купферовские) клетки обладают этой способностью в очень слабой степени.
Существуют также значительные различия в ферментном составе между гепатоцитами различных участков печеночных долей. Это связано с тем, что биотрансформация веществ локализована преимущественно в гепатоцитах центролобулярной (околовенозной) зоны. Именно в них сосредоточена большая часть гладкого эндоплазматического ретикулума, с которым связывается активность НАДФН-зависимых монооксигеназ. НАДФН-генерирующие ферриты также сосредоточены в этой области. Индукция ферментов системы микросомального окисления и эндоплазматического ретикулума барбитуратами выражена преимущественно в этой области. Гепатоциты околовенозной зоны особо чувствительны к электрофильной атаке токсических метаболитов, образованных системой цитохрома Р-450 из таких ксенобиотиков, как бромбензоат. Скорость образования токсических продуктов в них благодаря более высокой активности монооксигеназ вообще намного больше, нежели в околопортальных клетках. В то же время центролобулярные гепатоциты менее защищены от токсических продуктов, так как глутатионпероксидаза и глутатион локализованы преимущественно в околопортальных клетках.
