В интактной клетке процесс потребления кислорода связан не только с работой дыхательной цепи. Помимо нее, в различных компартментах протекают кислородзависимые реакции, катализируемые оксидазами и оксигеназами с неодинаковым сродством к кислороду. Их удельный вклад в клеточное дыхание может меняться в зависимости от функционального состояния и влиять на соотношение и направление метаболических потоков, сопряженных с этими реакциями. Косвенным подтверждением этого является вариабельность цианидчувствительного и цианидрезистентного дыхания, значения которых отражают вклад митохондриального и немитохондриального дыхания в суммарное потребление кислорода клеткой в различных стационарных состояниях.
Аналогичные данные получены на изолированных гепатоцитах в условиях активации свободнорадикальных процессов, в том числе и перекисного окисления липидов, которые имеют место, например, при длительной инкубации гепатоцитов и при повреждении плазматической мембраны. Во всех этих случаях цианидрезистентное дыхание увеличивалось либо при несущественных изменениях общего дыхания клеток, либо при его снижении, что свидетельствует об относительном увеличении немитохондриальных кислородутилизирующих процессов в валовом потреблении кислорода клеткой.
Имеются и более прямые доказательства участия в клеточном дыхании реакций, не связанных с активностью основной дыхательной цепи. Так, в присутствии метирапона — ингибитора цитохрома Р-450 — дыхание гепатоцитов уменьшается на 40%. Наблюдаемые изменения не являются результатом подавления функции дыхательной цепи, так как увеличение концентрации метирапона не влияет на дыхание. Более того, митохондриальная компонента дыхания сохраняется, так как цианид, добавленный после метирапона, ингибирует дыхание еще на 40%. Однако даже после этого остается еще около 20% клеточного дыхания, не чувствительного к ингибиторам двух основных электронтранспортных редокс-цепей.
Активация любой немитохондриальной кислородпотребляющей. системы сопровождается не только усилением утилизации кислорода гепатоцитами, как, например, в присутствии гликолата, окисляющегося в пероксисомах до H2O2, но и увеличением цианидрезистентного дыхания. Таким образом, немитохондриальные ферменты, субстратом которых является кислород, а также субстраты окисления, активирующие эти ферменты, могут участвовать в регуляции клеточного дыхания, влияя при этом одновременно на мощность и направление метаболических потоков.
Вопрос о значимости такой регуляции в жизнедеятельности клетки становится особенно важным в условиях кислородной недостаточности в связи с неодинаковой чувствительностью к ней различных кислородзависимых ферментных систем. Действительно, сродство различных оксидаз и оксигеназ к кислороду, которое может быть выражено значениями кажущейся Км(О2), различается на несколько порядков. Поэтому при снижении рО2 в определенных пределах его значений будет происходить инактивация кислородзависимых ферментов в соответствии с величиной их Км(О2), причем первыми должны страдать ферменты с низким сродством к кислороду. Естественно предположить, что это отразится на кинетической зависимости скорости дыхания от рО2 (Vд/рО2) (переход от гиперболической зависимости к линейной).
Вопрос об участии немитохондриальных кислородзависимых реакций в регуляции клеточного дыхания был подробно исследован нами на тканевых полосках. В результате было установлено, что одной из причин более низкого сродства клеток к кислороду по сравнению с изолированными митохондриями являются не столько диффузионные ограничения поступления кислорода в ткань, сколько влияние на процесс в целом немитохондриальных кислородзависимых реакций с высокими значениями кажущихся Км(О2).
Использование для решения этого вопроса суспензии изолированных гепатоцитов имеет серьезные преимущества, так как в этом случае диффузионные ограничения для О2 отсутствуют. Тем не менее при этом, так же как и в тканевых препаратах, сохраняется возможность направленного регулирования кинетической зависимости (Vд/рО2) путем искусственного торможения или активации кислородзависимых процессов с различными кажущимися Км(О2).
При окислении, например, гепатоцитами эндогенных субстратов цианидчувствительное дыхание составляет 80%, т.е. основным потребителем кислорода является дыхательная цепь. Поэтому дыхание лимитируется преимущественно активностью цитохромоксидазы, сродство которой к кислороду очень велико. Скорость дыхания гепатоцитов, окисляющих эндогенные субстраты, сукцинат и альфа-глицерофосфат, остается постоянной в широком диапазоне значений рО2 (от 240 до 15торр), как это и было показано Варбургом и Лонгмюром. Снижение дыхания начинается лишь при рО2 меньше 5торр. Тем не менее значения рО2, при которых достигается 50%-ное торможение дыхания, для изолированных клеток примерно на порядок больше, чем для изолированных митохондрий. По нашим данным, оно соответствует концентрации кислорода, равной 2-3мкМ, что согласуется с результатами, полученными Джоунсом.
По нашему мнению, одной из причин наблюдаемого расхождения чувствительности дыхания к кислороду различных объектов является то, что наряду с цитохромоксидазой в контроле дыхания принимают участие немитохондриальные ферменты с более низкими Км(О2). Например, зависимость остаточного дыхания от рО2 после ингибирования цианидом дыхательной цепи гепатоцитов, окисляющих эндогенные субстраты, оказывается не гиперболической, а практически линейной с очень высоким значением р50.
Если это так, то тогда можно ожидать, что активация цианиднечувствительных кислородпотребляющих процессов будет влиять на зависимость Vд/рО2, увеличивая р50. Проверка этого предположения была проведена нами совместно с А.Т. Уголевым. Действительно оказалось, что в присутствии гликолата — субстрата гликолатоксидазной кислородзависимой реакции — порог чувствительности дыхания гепатоцитов к снижению рО2 сдвигается вправо. Аналогичная картина имеет место и в присутствии урата. При этом в обоих случаях происходит увеличение цианидрезистентного дыхания, свидетельствующего об ограничении функции дыхательной цепи Км(О2) гликолатоксидазы и уратоксидазы одного порядка. Изменения зависимости Vд/рО2 при активации катализируемых этими ферментами реакций также практически одинаковы. Однако в присутствии субстратов дыхательной цепи сукцината и альфа-глицерофосфата ни гликолат, ни урат не могут существенно влиять на эту зависимость, которая остается такой же, как при окислении эндогенных субстратов.
Все это позволяет сделать вывод, что активация электронтранспортной функции дыхательной цепи снижает чувствительность клеточного дыхания к кислородной недостаточности, в то время как усиление альтернативных кислородзависимых немитохондриальных энергонезависимых процессов, ограничивающих, однако, относительное участие дыхательной цепи в валовом потреблении кислорода клеткой, увеличивает чувствительность клеточного дыхания к изменениям рО2. Оно выражается в увеличении p50 и влияет на форму кинетических кривых зависимости Vд/рО2. Таким образом, существует энергонезависимая компонента дыхания, участвующая в регуляции потребления кислорода клеткой в целом.
