Дыхание изолированных гепатоцитов, сопряженное с активностью митохондриальной дыхательной цепи

Дыхание гепатоцитов является параметром, отражающим ак­тивность множественных кислородзависимых процессов. Тем не ме­нее основная его часть связана с работой митохондриальной редокс-цепи и ее энергообразующей функцией, сопряженной с энергопотребляющими процессами. Первые, как известно, локализова­ны главным образом в митохондриях, вторые — преимущественно во внемитохондриальном пространстве.

Прижизненные кинетические исследования состояния дыхатель­ной цепи с помощью полярографического метода регистрации ды­хания и оптических методов оценки редокс-состояния дыхательных переносчиков позволили установить, что в гепатоцитах, так же как и в срезах печени и перфузируемой печени, сохраняются общие за­кономерности и принципы структурной организации дыхательной цепи, установленные для изолированной полиферментной системы митохондрий.

Состав и концентрация дыхательных переносчиков в гепатоци­тах близки к тому, что показано для изолированных митохондрий.

Отношение [цитохром с + с₁] / [цитохром а + а₃], по Уилсону, равно 1,8 , что сравнимо с митохондриями. Однако, согласно более поздним данным Джоунса, стехиометрия между этими двумя цитохромами составляет 1:1. Содержание цитохрома b₅₆₁ + b₅₆₆ в гепатоцитах несколько меньше, чем цитохрома а + а₃ и цитохрома с + с_1, и ниже, чем показано для митохондрий печени.

Окислительная способность клеточных препаратов соответству­ет окислительной способности перфузируемой печени и изолирован­ных митохондрий, так же как и эффективность окислительного фос­форилирования: на один пункт фосфорилирования образуется один моль АТФ.

В свежевыделенных гепатоцитах с интактными плазматически­ми мембранами содержание АТФ составляет 2,5 - 5,0 мкмоль на г^-1 влажного веса клеток, что весьма близко к значениям, показанным для перфузируемой пече­ни, и существенно выше, чем в срезах печени.

Отношение АТФ/АДФ в интактных изолированных гепатоци­тах, окисляющих эндогенные субстраты, равно 3-5, что также близко к значениям, полученным для печени; в отдельных случаях оно может быть значительно выше.

Следует отметить, однако, что содержание АТФ в изолирован­ных гепатоцитах коррелирует в целом с качеством выделения кле­ток и состоянием их плазматических мембран. Приведенные выше значения АТФ показаны для суспен­зии клеток, окрашиваемых трипановым синим, не более чем на 10%. В клетках с поврежденными мембранами имеет место спон­танный выход АТФ, приводящий к снижению в процессе ин­кубации ее содержания. Внутриклеточная концентрация АТФ за­висит также от среды инкубации и сопутствующих условий (оксигенации, температуры инкубации, состава инкубационных сред и субстратов окисления гормонов и пр.). При насыщении среды кислородом или введении в среду инкубации эритроцитов со­держание АТФ в клетке может увеличиться в 2 раза. Оптимальной для получения высоких значений АТФ является температура, близ­кая к физиологическим значениям (около 37°С). Ее снижение до 25°С уменьшает концентрацию АТФ в гепатоцитах в 2 раза.

Содержание адениннуклеотидов в различных препаратах печени крысы после 48ч голодания (перфузия печени и инкубация без субстратов)

Динамика содержания АТФ в гепатоцитах зависит от ис­ходных его значений. В сус­пензии с высоким содержани­ем интактных гепатоцитов при начальных значениях концент­рации суммарного АТФ не менее 1 мкмоль на г^-1 ткани в процессе инкубации может иметь место его увеличение, отражающее относительную стабилизацию энергетическо­го метаболизма, несмотря на то что прокрашиваемость кле­ток трипановым синим при этом может увеличиваться.

Эта закономерность, как пра­вило, отсутствует при исход­ном содержании АТФ в гепатоцитах менее 1 мкмоль на г^-1. Может быть, этим в значительной степени объясняются разногласия между различными авторами по поводу ди­намики содержания АТФ в гепатоцитах при длительном их инкубировании. Согласно одним исследователям, концентрация АТФ в гепатоцитах снижается во время инкубации. Согласно другим, наоборот, после кратковременного первичного, ви­димо, адаптационного периода имеет место постепенное увеличе­ние концентрации АТФ в клетках в течение 12-24 часов инкубации.

Дыхание клеток тесно сопряжено с энергетическим метаболиз­мом. Считается, что эндогенное дыхание интактных гепатоцитов отражает главным образом энергетические траты клетки, связан­ные с синтезом белка, секреторной функцией и поддержанием ионного градиента. Все эти метаболические процессы сохра­няются на высоком уровне в изолированных гепатоцитах в течение нескольких часов. Поэтому высокое эндогенное дыхание рассматривается как показатель высокого оборота АТФ для различных синтетических реакций и активного транспорта. Динамика дыхания суспензии гепатоцитов в процессе их инкубации отражает содержание и изменение суммарной концентрации АТФ: при отно­сительно высоких исходных значениях АТФ его последующее уве­личение во времени проходит на фоне увеличения дыхания. При низкой исходной концентрации АТФ дыхание во времени уменьша­ется. То, что дыхание гепатоцитов, поддерживаемое окис­лением эндогенных субстратов, осуществляется главным образом за счет активности дыхательной цепи митохондрий, подтверждает­ся ингибиторным анализом.

Разобщители окислительного фосфорилирования увеличивают скорость эндогенного дыхания суспензии клеток на 10-60%, что, однако, существенно меньше, чем в изолирован­ных митохондриях. Этот сравнительно небольшой их эффект в кле­точных препаратах обусловлен, по-видимому, во-первых, ограниченной проницаемостью данных веществ через плазматическую мембрану и, во-вторых, высокой АТФазной активно­стью, как это было показано для срезов печени. При блоке последней стимулирующее действие разобщителей увеличивается многократно. Эффект зависит от концентрации вещест­ва, причем стимуляция дыхания может сменяться торможением. Сравнительно слабое стимулирующее дыхание действие раз­общителей было описано для срезов печени и продемон­стрировано на перфузируемой печени. Одновремен­но со специфическим действием на дыхательную функцию клеток разобщители подавляют образование в гепатоцитах лактата, глю­козы и АТФ.

В присутствии KCN (2-3мМ) — ингибитора цитохромоксидазы — цианидрезистентное дыхание интактных гепатоцитов при окислении эндогенных субстратов составляет всего 2-10%. Аналогичные результаты получены при действии антимицина. Следовательно, не менее 90% эндогенного дыхания изолированных гепатоцитов обусловлено активностью митохонд­риальной редокс-цепи. В присутствии цианида наблюдается восстановление пиридиннуклеотидов (ПНН).

Следует отметить, что в суспензии, содержащей большое коли­чество поврежденных клеток, нечувствительность эндогенного ды­хания к цианиду (цианидрезистентное дыхание) также высока. Снижение количества поврежденных гепатоцитов идет параллельно с уменьшением цианидрезистентного дыхания. На­помним, что последнее рассматривается как показатель интенсив­ности кислородзависимых процессов, не связанных с активностью основной дыхательной цепи. В связи с этим высокое цианидрезистентное дыхание следует, по-видимому, трактовать как усиление немитохондриальных кислородпотребляющих процессов в поврежденных гепатоцитах.

Вклад НАД-зависимого окисления в эндогенное дыхание гепа­тоцитов относительно невелик. Амитал — ингибитор транспорта электронов в НАД-зависимом участке дыхательной цепи — подав­ляет эндогенное дыхание клеток на 15-30% при насыщающих кон­центрациях ингибитора (3мМ). Его действие сопро­вождается восстановлением пиридиннуклеотидов, причем окисли­тельно-восстановительные превращения проходят в характерном колебательном режиме. Окисляющий эффект нараста­ет с увеличением концентрации амигала и может быть отражением усиления гликолиза и окисления НАДН в цитозольном компартменте в реакции восстановления пирувата в лактат.

Цианид, добавленный после амитала, почти полностью подав­ляет амиталнечувствительное дыхание и может незначительно вос­становить ПНН. Следовательно, слабое, ингибирую­щее дыхание действие амитала при окислении гепатоцитами эндо­генных субстратов и при сохранении высокой чувствительности дыхания к ингибитору терминального участка дыхательной цепи от­ражает поступление в дыхательную цепь потока электронов в об­ход амиталчувствительного участка. Это и понятно, так как извест­но, что в изолированных гепатоцитах эндогенное дыхание поддерживается окислением эндогенных жирных кислот.

Относительно небольшой вклад НАДН-оксидазного пути окис­ления в поддержании активности дыхательной цепи гепатоцитов, окисляющих эндогенные субстраты, отмечали и другие исследова­тели. Так, Мольдеус показал, что в присутствии ротенона концентрация АТФ в клетках уменьшается всего на 5-10%. Это не связано с каким-то нарушением электронтранспортной функции субстратного участка дыхательной цепи, так как экзогенные НАД- зависимые субстраты, несмотря на их плохую проницаемость че­рез плазматическую мембрану, не только стимулируют дыхание клеток и восстанавливают ПНН, но и увеличивают амиталчувствительное дыхание. Действие НАД-зависимых субстратов резко уменьшается на фоне ингибиторов дыхательной цепи — амитала и цианида. Следо­вательно, в изолированных гепатоцитах, окисляющих эндогенные субстраты, НАДН-оксидазный путь основной дыхательной цепи ис­пользуется ими немаксимально, но он может быть активирован эк­зогенными НАД-зависимыми субстратами.

Так как экзогенный сукцинат плохо проникает через плазмати­ческие мембраны, он слабо стимулирует дыхание суспензии с боль­шим количеством неповрежденных клеток. Коэффициент дыха­тельного контроля при окислении сукцината в этом случае равен 1,2 - 1,4. Тем не менее при этом удается зарегистрировать количе­ственно небольшое и нестабильное сравнительно с тканевыми пре­паратами восстановление ПНН, протекающее в колебательном режиме. Это может быть связано с окислением сукцината не только в поврежденных клетках, но и в интактных, так как по­казана возможность медленного проникновения очень небольшого количества экзогенного сукцината через неповрежденные плазма­тические мембраны.

В присутствии сукцината чувствительность дыхания к амиталу полностью исчезает. Более того, может иметь место даже стимуляция потребления кислорода. Характерного восстановления ПНН в этом случае также не происходит. Восстановление ПНН от сукцината, не реализуемое в при­сутствии амитала или цианида, видимо, связано с обратным переносом электронов. Таким образом, экзогенный сукцинат активирует сукцинатоксидазный путь окисления в дыхатель­ной цепи изолированных гепатоцитов.

Обращает на себя внимание также стимуляция дыхания гепа­тоцитов экзогенным НАДН, который, как и сукцинат, плохо проникает через интактную плазматическую мем­брану, а также мембрану митохондрий. В суспензии гепатоцитов с интактными мембранами (80% и более непрокрашенных клеток) увеличение скорости потребления кислорода в присутствии НАДН за счет поврежденных клеток (коэффициент дыхательного кон­троля при окислении НАДН) составляет 150-200% на протяже­нии 2ч инкубации. При этом увеличивается и чувствительность дыхания (сравнительно с эндогенным) к амиталу, особенно у свежеизолированных гепатоцитов. Если НАДН был добавлен на фон амитала, его стимулирующий дыхание эффект снижался приблизительно на 60%. Следовательно, в изолированных гепатоцитах, так же как и в срезах печени, возможно окисление некоторой части экзогенного НАДН по амиталнечувствительному пути, что может быть связано с работой челночных механизмов переноса восстановительных эквивалентов.

Таким образом, ингибиторный анализ интактных клеток позволяет оценить вклад митохондриальных и немитохондриальных кислородзависимых процессов и их соотношение, относительную мощ­ность метаболических потоков и их модификации в условиях изменения стационарного состояния.

Некоторые субстраты углеводного и жирового обмена (пируват, лактат, олеат и др.), так же как и в перфузируемой печени могут стимулировать дыхание клеток. Это связано с активацией ряда специфических для печени энергозависимых синтетических процессов — глюконеогенеза, синтеза мочевины, липогенеза. Уве­личение потребности в АТФ при инициации этих процессов усили­вает электронтранспортную функцию митохондриальной дыхатель­ной цепи и сопряженные с ней потребление кислорода и окислительное фосфорилирование, что в конечном итоге приводит к образованию АТФ, компенсирующему его расход. Эти энергопотребля­ющие процессы дают наибольший вклад в дыхательную компонен­ту клетки.

В присутствии, например, лактата, стимулирующего дыхание изолированных гепатоцитов примерно на 50% , активи­руется глюконеогенез, особенно в клетках, истощенных по глико­гену. Скорость глюконеогенеза из лактата лишь немногим меньше, чем в перфузируемой печени, но она полностью компенсируется до­бавлением лизина, который вымывается из клеток при их выделе­нии. Высокая скорость синтеза мочевины также коррелирует с высокой скоростью дыхания. Однако и в этом случае она несколько меньше, чем в перфузируемой печени, и полностью восстанавлива­ется в присутствии орнитина и лактата, также вымываемых из клетки. Длинноцепочечные жирные кислоты (олеат, пальмитат, октаноат) также являются активаторами глюконеогенеза. В их присутствии наблюдается увеличение потребления кислорода на 30-100%, сопряженное с увеличением образования АТФ. В присутствии субстратов, поддерживающих одновременно макси­мальные скорости синтеза мочевины из NH₄Cl и синтеза глюкозы из лактата и орнитина, скорость потребления кислорода гепатоцитами может увеличиться до 11 мкмоль в мин^-1 на г^-1, что суще­ственно выше, чем в перфузируемой печени. Таким образом, высо­кие скорости дыхания в значительной степе­ни обусловлены ресинтезом АТФ.

При обеспечении максималь­ной скорости глюконеогенеза из лактата и максимальной скорости синтеза мочевины скорость образования АТФ составляет 72% от максимальной скорости образования АТФ за счет аэробного окис­ления, сопряженного с дыханием. При немаксимальной скорости окислительного фосфорилирования скорость синтеза АТФ может становиться лимитирующим звеном процесса. Следовательно, процессы дыхания, образования и расходования АТФ в специфических для клеток метаболических процессах тесно сопряжены.

Среди других АТФ-зависимых процессов в гепатоцитах наибольшее значение имеет поддержание концентрационного градиента (клетка — внешняя среда) для неорганических ионов и легко диффундируемых низкомолекулярных веществ, например аминокислот. Энергетическая потребность в активном транспорте не определена, однако известно, что в срезах печени до 40% дыхания вязано с натрий-калиевым обменом. Подтверждением этому является действие уабаина — ингибитора К-Nа-зависимой АТФазы, который подавляет дыхание изолированных гепатоцитов.

Существенная часть потребляемого клеткой кислорода может быть также связана с использованием энергии в реакциях межкомпартментного переноса Н⁺ и сопряженной с ней транслокацией метаболитов. Наконец, еще одна энергопотребляющая реакция в клетках печени — это синтез гликогена из глюкозы.