Клетки печени in vivo осуществляют липолиз триглицеридов, окисление жирных кислот и кетогенез. Синтетические реакции связаны с образованием жирных кислот из ацетил-КоА: удлинением углеводных цепей жирных кислот, эстерификацией их, накоплением триглицеридов и экскреций триглицеридов во внешнюю среду в форме липопротеидных комплексов. Хотя многие органы млекопитающих способны синтезировать холестерин, роль печени в этом процессе очень велика, так как в ней образуется 80% всего холестерина.
Естественные компоненты плазмы крови, участвующие в жировом обмене в целом организме, представлены липопротеидными комплексами, которые служат субстратами метаболических систем клеток печени.
При оценке функциональной полноценности изолированных гепатоцитов особое значение придается способности клеток секретировать или поглощать липиды с последующим их окислением или эстерификацией.
Плазматическая мембрана и липидный обмен в гепатоцитах
Клеточная мембрана содержит на своей поверхности рецепторы, связывающие липопротеидные комплексы с высокой степенью сродства и специфичности. Связывание является первым и обязательным этапом в цепи метаболических превращений липопротеидов очень низкой плотности (ЛОНП), хиломикронов, или попротеидов высокой плотности (ЛВП) и липопротеидов низкой плотности (ЛНП).
Максимальная интенсивность связывания, в частности ЛОНП, отмечается только при 37°С и обеспечивает одновременную утилизацию 6-10 молекул ЛОНП на каждую изолированную клетку. Однако в процессе выделения гепатоцитов коллагеназным методом эта активность снижается или даже исчезает и клетки теряют способность осуществлять метаболизм липопротеидов, присущий состоянию in vivo. Различная степень повреждения липазной активности при выделении гепатоцитов может быть причиной получения противоречивых результатов. По данным Номура с соавторами, присутствие в среде инкубации хиломикронов и их остатков приводит к выраженному угнетению гликолиза, синтеза жирных кислот и холестерина. Результаты других авторов свидетельствуют, что инкубационная смесь, содержащая ЛОНП, хиломикроны и их остатки, вызывает значительное ингибирование синтеза жирных кислот, но не холестерина.
Противоречия в результатах могут быть связаны также с использованием препаратов липопротеидных комплексов, загрязненных естественными компонентами плазмы. Использование таких препаратов в инкубационных средах может вызывать в гепатоцитах метаболический ответ, близкий по направленности к физиологическому, но в любом случае он будет артефактом, так как количественная характеристика реакции зависит от способа получения липопротеидных комплексов и степени их чистоты. Это предположение было подтверждено в экспериментах с использованием очищенной фракции хиломикронов и в присутствии различных концентраций олеата.
Инкубация свежевыделенных клеток печени в среде, содержащей очищенные хиломикроны, вызывала ингибирование синтеза жирных кислот, хотя метаболизм холестерина не менялся. Использование экзогенного олеата в концентрациях, близких к загрязняющим количествам жирных кислот (0,25 - 0,5мМ), незначительно снижало их биосинтез. Авторы расценили это как отсутствие эффекта. Однако можно предположить, что в участках связывания и метаболического превращения ЛОНП и хиломикронов концентрация загрязняющих жирных кислот может быть выше и следовательно, эффект должен быть более выраженным. Действительно, при включении в среду с клетками печени олеиновой кислоты в концентрациях, превышающих загрязняющие количества в 2-4 раза, скорость синтеза жирных кислот и холестерина снижалась на 50%.
Отсутствие ингибирования синтеза холестерина очищенными хиломикронами, ЛОНП, остатками липопротеидов, липопротеидами низкой и высокой плотности может быть объяснено тем, что инкубация продолжалась 45мин - 2ч, тогда как требуется значительно больше времени, чтобы проявилось ингибирование 3-окси-3-метил-глутарилКоа-редуктазной активности, ответственной за скорость синтеза холестерина.
Из анализа описанных экспериментальных фактов становится очевидным, что свежеизолированные гепатоциты с поврежденными липазами липопротеидов плазматических мембран не пригодны для изучения поглощения и деградации липопротеидных комплексов. Бессмысленно вводить липидные субстраты в такой форме в инкубационную среду.
Липопротеиды низкой плотности являются главными переносчиками холестерина в плазме крови и до 60% этих липопротеидов подвергается деградации в клетках печени. Утилизация экзогенного холестерина in vivo происходит по пути экскреции его в виде свободного холестерина желчи или желчных кислот или выделения в плазму снова в виде липопротеидов. Физиологическое значение такого кругооборота липопротеидов низкой плотности до конца не ясно. Возможно, что печень выполняет роль коллектора холестерина при его избытке в окружающей среде.
Несмотря на то что свежеизолированные гепатоциты демонстрируют скорость синтеза холестерина, близкую к скоростям в печени in vivo, и при этом процесс остается линейным в течение 1ч инкубации, такие клетки все же не пригодны для изучения регуляторных механизмов холестеринового обмена. Это связано с тем, что получение интересующих метаболических ответов требует многих часов инкубации и возможно в условиях культуры или in vivo.
Это заключение подтверждают данные о том, что липопротеидные комплексы, регулирующие холестериновый обмен в клетках печени, в основном за счет влияния на активность З-окси-З-метил-глутарилКоА-редуктазы, появляются в крови после нескольких суток гиперхолестеринемии. Использование такой фракции липопротеидов целесообразно только при наличии гепатоцитов с интактными участками связывания ЛНП, которые легко повреждаются протеолитическими ферментами и восстанавливаются в условиях культуры.
