Синтез мочевины в изолированных гепатоцитах

Клетки печени, участвуя в белковом обмене, непрерывно синте­зируют нетоксичный, водорастворимый продукт — мочевину. Ос­новным источником аммония, используемого для этого процесса в целом организме, является портально-венозная кровь, которая содержит значительные его количества, получаемые в основном при дезаминировании глутамина и в результате аминотрансферазных реакций.

В настоящее время особое внимание уделяется детальному изу­чению отдельных стадий и механизмов регуляции синтеза мочеви­ны, связанных с доступностью промежуточных метаболитов и ам­мония. При этом в качестве модели эффективно используются интактные изолированные гепатоциты.

Высокая эффективность и скорость развития ингибирующего действия аммония на интенсивность деградации белка в свежеизолированных гепатоцитах позволяет широко применять NH₄Cl в ин­кубационных средах. Высокие концентрации экзогенного аммония и глутамина, используемые с этой целью, оказывают существенное влияние на процессы синтеза мочевины в изолированных клетках.

В процессе синтеза мочевины часть азота поступает из аммония, а часть из аспартата. Основным предшественником аммония в пе­чени является глутамат. Азот глутамата или освобождается при окислении и включается в синтез карбамоилфосфата, или используется для синтеза аспартата в процессе восстановительного аминирования оксалоацетата. Глутамат образуется в результате гид­ролиза белка, трансаминирования аланина, аспартата, тирозина, фенилаланина, лизина, орнитина или при деградации гистидина, пролина и аргинина.

Общепринятая концепция о ведущей роли глутаматдегидрогеназной реакции в освобождении основной массы аммония, необхо­димого для синтеза мочевины в печени, была подвергнута сомнениям Макгиваном и Чэппелом в 1975г. Они предполо­жили, что аммоний образуется не из глутамата через глутаматдегидрогеназную реакцию, а из аспартата через цикл пуриновых нуклеотидов. Их предварительное заключение базировалось на факте, что скорость дезаминирования глутамата изолированными митохондриями печени слишком низка для эффективного образо­вания мочевины in vivo и что инкубация изолированных гепатоцитов в присутствии лейцина сопровождается торможением образо­вания мочевины. А так как лейцин не влияет на синтез цитруллина из орнитина, бикарбоната и аммония в изолированных митохондриях, они заключили, что лейцин не действует непосредственно на цикл мочевины. Следовательно, пункт контроля скорости образова­ния мочевины может лежать за пределами известной последовательности превращений.

Однако Кребсом с соавторами было показано, что лейцин ингибировал синтез мочевины в изолированных гепатоцитах из аланина, NH₄Cl, глутамина, аспарагина. Действие лейцина снима­лось высокими концентрациями орнитина, которые использовали Макгиван и Чэппел в экспериментах с изолированными ми­тохондриями in vitro. Эффекты лейцина и орнитина объясняются конкуренцией за связывание в активном центре орнитинкарбомоилтрансферазы. Поэтому отсутствие ингибирующего действия лейцина в изолированных митохондриях можно объяснить использовани­ем высоких, нефизиологических концентраций орнитина. Низкая скорость освобождения аммония из глутамата в изолированных митохондриях обусловлена в основном низкой скоростью проник­новения последнего через митохондриальную мембрану и не соответствует состоянию in vivo.

Дальнейшее подтверждение несостоятельности аргументов, вы­двинутых в пользу ведущей роли цикла пуриновых нуклеотидов при образовании аммония из аспартата, получили Кребс с соавторами благодаря использованию [¹⁵N]-аланина для измерения ско­рости включения метки в 6-аминогруппу адениннуклеотидов и в мо­чевину. Оказалось, что скорость оборотов адениннуклеотидов в цикле и связанная с ней интенсивность дезаминирования аспартата в изолированных гепатоцитах крысы недостаточны для обеспечения зарегистрированного выхода аммония. Полученные результаты окончательно подтвердили классические представления о том, что аммоний, необходимый для карбамоилфосфатсинтетазной реакции, может быть обеспечен активностью глутаматдегидрогеназы.

В условиях суспензии изолированных гепатоцитов, когда клетки используют эндогенные продукты деградации белка и обмена аминокислот, скорость синтеза мочевины составляет около 0,05 - 0,06 мкмоль в мин^-1 на г^-1 влажного веса клеток. Добавление экзогенного аммония стимулирует процесс незначительно. Добавле­ние же орнитина резко увеличивает скорость производства мочеви­ны из аммония до 0,5 - 0,6 мкмоль в мин^-1 на г^-1 влажного веса клеток. При этом скорости синтеза мочевины и поглощения аммония оставались линейными, пока концентрация NH₄Cl в суспензии не падала ниже 1мМ.

Синтез мочевины из аммония изолированными гепатоцитами в присутствии орнитина (10мМ) вместе с такими субстратами цикла Кребса и глюконеогенеза, как лактат, пируват, аланин, глутамин, аспартат, увеличивается в 2-3 раза. При этом максимальная скорость (1,8 мкмоль в мин^-1 на г^-1 влажного веса печени) отмечается в присутствии лактата (10мМ). Выраженная зависимость скорости образования мочевины в изолированных гепатоцитах от содержания в инкубационной среде доноров аммония и некоторых промежуточ­ных продуктов этого синтеза свидетельствует об их дефиците, что следует учитывать при выборе состава инкубационной среды. Сни­жение содержания ряда метаболитов в гепатоцитах может быть свя­зано с процессом их выделения.

Таким образом, при моделировании синтеза мочевины в изоли­рованных гепатоцитах необходимо учитывать возможность возник­новения по крайней мере двух лимитирующих участков. Один из них может быть связан с недостатком промежуточного метаболита син­теза мочевины — орнитина, а другой — с дефицитом некоторые предшественников глюконеогенеза и субстратов цикла трикарбоновых кислот, которые необходимы для синтеза аспартата.

Дефицит аспартата может возникнуть не только в результате потери непосредственных предшественников его синтеза, но и вслед­ствие активного синтеза глюкозы при истощении запасов гликогена в гепатоцитах. Это предположение подтверждается тем, что в гепа­тоцитах из печени голодавших крыс содержание малата в цитозоле ограничивает его транспорт в митохондрии и снижает производство аспартата в митохондриях.

Однако в основе регуляторных механизмов скорости синтеза мо­чевины в изолированных гепатоцитах лежит не только доступность субстратов к ферментам. Стимулирующее влияние лактата на ско­рость образования мочевины может быть сопряжено с образовани­ем дополнительных количеств энергии для нужд синтеза. Энергети­ческие потребности синтеза достаточно высоки и теоретически составляют 4 моля АТФ/моль мочевины. В присутствии экзо­генных жирных кислот, которые являются более эффективными энергетическими субстратами, чем лактат, скорость производства мочевины возрастает в несколько раз.

В присутствии олеата (0,5мМ) и орнитина (2,5мМ) добавление как высоких (8мМ), так и низких (2мМ) концентраций аммония приводит к увеличению интенсивности синтеза до 1,7 - 2,5 мкмоль в мин^-1 на г^-1 влажного веса клеток.

Стимулирующее действие лактата отсутствует в перфузируемой печени и клетках, выделенных от сытых крыс, в которых имеется его потенциальный источник в виде запасов гликогена. По­этому лактат и другие трехуглеродные метаболиты могут стимулировать образование мочевины из аммония за счет обеспечения син­теза аспартата углеродными остатками.

Более вероятным объяснением действия лактата является огра­ниченная доступность аспартата для процессов, компартментализованных в цитозоле, так как для синтеза мочевины важно содержа­ние аспартата в цитозольном пуле. Аспартат может синтезироваться в цитозоле и в митохондриях. В обоих случаях предшественником является оксалоацетат, который поступает из митохондрий благодаря челночному переносу в виде малата либо аспартата. Этот челночный механизм может регулировать процесс синтеза мочевины и процесс глюконеогенеза. Когда изолированные гепатоциты активно синтезируют глюкозу из экзогенного пирувата, оксалоацетат поступает в цитозоль в виде малата, который уже со­держит в себе восстановительные эквиваленты, необходимые для производства глюкозы. Если синтез углеводов идет из лактата, то главной формой переноса оксалоацетата является аспартат, кото­рый может быть использован для синтеза мочевины.

Таким образом, когда синтез мочевины обеспечивается пируватом, орнитином и аммонием, основными источниками аспартата становятся цитозольные процессы и при этом активируется цитозоль­ная аспартатаминотрансфераза. В присутствии лактата аспартат синтезируется в митохондриях соответствующим повышением ак­тивности митохондриальной аспартатаминотрансферазы.

С представленных позиций может быть объяснен наблюдаемый рядом авторов более выраженный эффект стимуляции лактатом синтеза мочевины по сравнению с пируватом и аммонием в присут­ствии орнитина.

Второй лимитирующий участок синтеза мочевины связан с не­достаточным содержанием орнитина в гепатоцитах при использова­нии аммония в качестве основного донора азота. В инкубаци­онную среду обычно добавляют 1-2мМ орнитина с целью оптимизации каталитических концентраций его внутри клетки для обеспе­чения стационарной скорости синтеза мочевины.

Следует помнить, что орнитин может использоваться клеткой как субстрат в следующем многостадийном процессе: орнитин + 2 α-кетоглутарат + НАД⁺ =2 глутамат + НАДН. Такая анаплеротическая роль орнитина по обеспечению синтеза мочевины глутаматом была продемонстрирована Мейером с соавторами при использо­вании гепатоцитов из печени голодных крыс. Чтобы компен­сировать дополнительные потребности изолированных гепатоцитов в орнитине, связанные с синтезом глутамата, вероятно, следует или увеличить концентрацию орнитина в инкубационной среде, или ис­пользовать субстраты, восполняющие дефицит глутамата в клетках.

Существует необходимость тщательного подбора вносимых кон­центраций аммония и орнитина в силу сложных взаимоотношений между системами мочевинообразования и пиримидинового синтеза на уровне общего метаболита — карбамоилфосфата, синтез которо­го обеспечивается в клетках печени двумя ферментами. Один лока­лизован в митохондриях и поставляет карбамоилфосфат для произ­водства мочевины, другой содержится в цитозоле и обеспечивает пиримидиновый синтез. Вендлер с соавторами продемонстрировал, что при насыщающих концентрациях аммония (3-5мМ) в среде инкубации изолированных клеток включение (¹⁴C)-NaHCO₃ в оротат увеличивается в 170 раз. При физиологических концентра­циях аммония (0,7мМ) биосинтез пиридинов возрастает только в 70 раз и предотвращается добавлением орнитина.

Следует отметить, что такие классические регуляторы синтеза мочевины в состоянии in vivo, как карбамоилфосфатсинтетаза и аргининосукцинатсинтетаза, не ограничивают скорость цикла в изо­лированных клетках печени при инкубации с экзогенными субстратами в присутствии NH₄Cl в качестве основного источника азота.

Важная роль глутаматдегидрогеназной реакции в регуляции синтеза мочевины обусловлена высокой чувствительностью фермен­та к различным эффекторам энергетического метаболизма. Глутаматдегидрогеназа катализирует восстановительное аминирование α-кетоглутарата. При этом используются или НАДН или НАДФН.

Предварительная оценка относительного вклада пиридиннуклеотидов в аминирование показала, что в основном используется НАДФН, генерируемый НАДФН-зависимой изоцитратдегидрогеназой.

Ингибирование НАДФН-изоцитратдегидрогеназы α-метилизоцитратом, который не затрагивает НАДН-зависимый фермент, снижало скорость синтеза мочевины в изолированных клетках пече­ни почти на 80% в условиях инкубации с субстратами, требующими восстановительного аминирования α-кетоглутарата до глутамата при синтезе аспартата. Такими субстратами оказались L-серин, D-аланин, NH₄Cl + лактат. В случае использования субстратов, не требующих предварительного образования глутамата (L-аланин, L-глутамин, L-аспарагин или NH₄Cl + L-орнитин), снижение активности НАДФН-изоцитратдегидрогеназы не сказывалось на интен­сивности мочевинообразования. Интенсификация синтеза мочевины приводила к снижению содержания НАДФН.

Эти факты свидетельствуют о преобладании НАДФН-зависимых процессов в обеспечении синтеза мочевины восстановительными эквивалентами. Однако существуют метаболические ситуации, ког­да восстановительные эквиваленты могут поступать из НАДН-зависимых систем клетки. Ингибирование процесса α-метилизоцитра­том частично предотвращалось олеатом, октаноатом и триоксибутиратом; т.е. в условиях, когда в клетке имеется достаточное количество НАДН, а синтез мочевины идет с высокой скоростью, восстановительные эквиваленты для аминирования α-кетоглутарата могут обеспечиваться как за счет НАДФН, так и за счет НАДН, образованного в результате окисления лактата или жирных кислот.

Описанные метаболические особенности восстановительного аминирования будут неполными, если не указать, что сам глутамат обычно не используется в качестве субстрата для синтеза мочевины изолированными гепатоцитами в связи с плохой его проницаемо­стью через плазматическую мембрану. Поэтому обычно ис­пользуют пролин в качестве предшественника глутамата. Превращение пролина в глутамат происходит в результате двухстадийного процесса с участием НАД-зависимого фермента, локализованного в митохондриях и в цитозоле. Дальнейший метаболизм глута­мата может лимитироваться скоростью реокисления НАДН в ды­хательной цепи митохондрий.

В заключение отметим, что при инкубации свежеизолированных интактных клеток печени в среде Кребса-Рингера с 2%-ным аль­бумином и необходимыми субстратами, о которых говорилось вы­ше, удалось зарегистрировать скорость синтеза мочевины около 1,0мкмоль в мин^-1 на г^-1 влажного веса клеток. Это составило 0,6г мочевины за сутки в расчете на целую печень, что совпадает со ско­ростью экскреции мочевины интактными крысами — 0,65 г/сут.