Скорость деградации внутриклеточного белка в свежеизолированных гепатоцитах достигает 4% в час. В состоянии in vivo она составляет 2% в час. Однако гепатоциты сохраняют способность отвечать на регуляторные воздействия, в том числе на гормональные; так, скорость разрушения предварительно меченного белка в первичной суспензии гепатоцитов контролируется инсулином, глюкагоном и концентрацией плазматических аминокислот. Сохранение регуляторных механизмов протеолиза в гепатоцитах позволяет надеяться, что создание соответствующих условий для их экстирпации и инкубации может вернуть клетки в режим сбалансированного обмена.
На сегодняшний день установлено, что лизосомальные ферменты играют основную роль в кругообороте белка в клетке и что лизосомальный протеолиз составляет 75% от общего белкового распада. Катаболическое состояние изолированных гепатоцитов сопровождается выраженными морфологическими изменениями, отличающими их от клеток ткани печени в состоянии in vivo. Высокая скорость деградации белка сопровождается увеличенным содержанием аутофагосом, а ее снижение в присутствии хлористого аммония коррелирует с лизосомальной вакуолизацией.
Наиболее активными лизосомальными протеазами являются катепсин В и Д. Доказательства этого были получены в исследованиях с использованием таких ингибиторов протеаз, как лейпептин и пепстаин, которые снижали деградацию белка на 40-60%. Лейпептин является ингибитором тиоловых протеаз, к которым относится катепсин В, а пепстаин инактивирует кислые протеазы типа катепсина Д. Причиной снижения интенсивности распада белка на 10-20%, полученного некоторыми авторами, может быть различное время полужизни используемых белков. В провессе деградации белка в гепатоцитах интенсивно образуется промежуточный продукт аминокислотного метаболизма — аммоний, который селективно накапливается внутри лизосом. Добавление экзогенного аммония, метиламина и других слабоосновных алкиламинов к интактным клеткам вызывает депрессию целого ряда лизосомальных функций, в том числе и деградацию протеинов. Этот эффект обусловлен повышением лизосомального pH от 4,5 - 5,0 до нейтральных значений.
Таким образом, существует реальная возможность влиять на интенсивность распада белка при помощи модификаторов лизосомальных функций либо через неспецифические инактиваторы, либо через специфические ингибиторы лизосомальных протеаз. Однако изолированные гепатоциты, несмотря на катаболический характер белкового обмена в первые часы инкубации, способны существовать в монослойной культуре на протяжении нескольких дней, осуществляя анаболический обмен. Это говорит о том, что их катаболическое состояние может быть обращено условиями культивирования или изменением клеточного метаболизма. Подтверждением этому служит результат, полученный при инкубации гепатоцитов в среде Dulbecco’s, обогащенной аминокислотами и витаминами, которая способствует возрастанию скорости выхода из клеток азота, аминокислот и мочевины в первые 2 часа за счет деградации белка. Продолжение инкубации ведет к резкому снижению потери белка в следующие 2 часа.
Чтобы установить причину стабилизации белкового обмена в процессе инкубации, Сеглен довольно детально проанализировал влияние возможных факторов, связанных как со средой, так и с метаболизмом изолированных гепатоцитов. Ему удалось показать, что при инкубации свежеизолированных клеток или в среде, уже использованной однажды для инкубации суспензии, или в виде плотного осадка в свежей среде исчезает первый двухчасовой период активации распада белка. Эффект связан со средой инкубации, вероятно, за счет изменения pH или развития локальной гипоксии. При этом изменение pH от 6,6 до 8,0 не сказывается на белковом метаболизме.
Инкубация гепатоцитов в течение первого часа характеризовалась выраженным выходом аминокислот из клеток при концентрации кислорода менее 10% и поглощением их при повышении pO2. Следовательно, гиперкатаболический тип метаболизма первой половины инкубационного периода был связан с гипоксическими условиями. В течение второго часа инкубации аминокислоты экскретировались в среду и при нормоксии и при полной аноксии, но при гипоксических условиях (5-10% содержания кислорода) аминокислоты начинали утилизироваться клетками. Таким образом, гипоксия второго периода сопровождалась анаболическим направлением обмена аминокислот.
Анализ общего баланса азота, связанного с образованием мочевины и обменом аминокислот в описанных условиях, показал, что антикатаболический обмен второго часа является следствием предшествующего гиперкатаболизма. Это могло происходить в результате накопления гипотетического антикатаболического фактора в процессе повышенной деградации аминокислот и параллельного снижения интенсивности синтеза мочевины в условиях гипоксии первого периода. При этом инкубация клеток печени в присутствии 10мМ NH4Cl снижала белковую деградацию на 42-43%, а обязательным компонентом среды инкубации с протектирующими свойствами является глутамин. Эти факты позволили заключить, что антикатаболический второй период инкубации, наблюдаемый уже через 2ч в обогащенной аминокислотами среде для культивирования клеток, обусловлен высокой концентрацией аммония, образовавшегося в результате интенсивной утилизации гепатоцитами глутамина инкубационной среды. Более короткое время, необходимое для наступления второго периода в условиях гипоксии, объясняется ускоренным образованием эффективной концентрации аммония из-за снижения интенсивности мочевинообразования при гипоксическом дефиците энергии в клетке.
Таким образом, аммоний способствует переходу гепатоцитов на анаболический тип метаболизма, обеспечивая сбалансированный азотистый обмен. При этом клетки вырабатывают эндогенный аммоний при инкубации лишь в условиях, близких к физиологическим, которые определяются не только содержанием глутамина в среде инкубации, но и строгим качественным соотношением компонентов в аминокислотной смеси. Так, ингибирование белковой деградации при добавлении сыворотки крови к инкубационной среде или при внесении некоторых аминокислот и их смесей в перфузат печени свидетельствует о регулирующем влиянии аминокислот на белковый обмен. Цельная сыворотка крови не только снижает интенсивность деградации белка в свежеизолированных клетках, но и поддерживает в течение 2ч инкубации секрецию белка гепатоцитами в окружающую среду со скоростью, близкой к физиологической.
Исследования влияния смесей аминокислот на процессы деградации белка в монослойной культуре клеток печени крысы помогли уточнить роль отдельных аминокислот в регуляции стабилизации азотистого обмена. Белковый обмен гепатоцитов в условиях культуры по своим метаболическим характеристикам приближается к состоянию in vivo.
Соммеркорн и Свик показали, что клетки, предварительно выдержанные в течение 48ч в условиях монослойной культуры и достигшие устойчивого анаболического режима обмена, после удаления полной среды инкубации начинали увеличивать скорость деградации белка и переходили в катаболический режим жизнедеятельности. В среде Хенкса к 3, 6 и 18 часам эта скорость достигала соответственно 6,6 и 4% в час. Инкубация клеток после начала ускоренного разрушения белка в полной среде (среда WOBA) приводила к ингибированию до 4, 3 и 2% в час к 3, 6 и 18 часам соответственно, т.е. до величин in vivo. Введение в сбалансированную минимальную солевую среду 2,4мМ глутамина имело слабый эффект. В те же время аммоний уменьшал деградацию белка на 25% как в минимальной солевой, так и в полной средах. Таким образом, влияние аммония на гепатоциты сохраняется в культуре. Слабое воздействие глутамата в этих условиях может быть объяснено различным состоянием метаболизма в клетках культуры и гепатоцитах, травмированных недавним выделением. Высокая скорость утилизация глутамина в условиях культуры сопровождается интенсивным связыванием аммония в процессе синтеза мочевины, предотвращающим создание эффективной концентрации последнего в среде.
Максимальное ингибирование отмечается в среде с незаменимыми аминокислотами. На долю триптофана и фенилаланина приходится 40-50% ингибирующего действия смеси незаменимых аминокислот. Присутствие метионина ограничивает влияние этих аминокислот, так как белковая деградация в смеси с метионином выше, чем без него. Метионин вместе с триптофаном и пролином вообще не ингибируют протеолиз.
Как указывалось выше, деградация эндогенного клеточного протеина непрерывно поддерживает запас аминокислот для синтеза тех белков, которые необходимы для выживания клетки в условиях ограниченного поступления экзогенных субстратов или их качественной неполноценности. Регуляция белковой деградации незаменимыми аминокислотами более специфична и в большей степени ограничивает эндогенное разрушение белка. Это связано с тем, что источником незаменимых аминокислот при их недостатке в среде не может быть ни переаминирование, ни синтез de novo, а только распад белковых молекул, содержащих эти аминокислоты, с такими скоростями и в таком количестве, которые полностью удовлетворяют потребности клетки в дефицитном пластическом материале. Дефицит триптофана и фенилаланина, ингибирующих белковую деградацию в наибольшей степени, ограничивает белковый синтез.
Это можно сказать и о метионине, но при некоторых условиях он может противодействовать влиянию фенилаланина и триптофана. Поэтому не исключается возможность, что некоторые комбинации аминокислот создают дисбаланс в инкубационных смесях.
Следовательно, регуляция белковой деградации незаменимыми аминокислотами в условиях ограниченного экзогенного обеспечения ими имеет важное значение для поддержания внутриклеточного аминокислотного пула.
Изложенное толкование последовательности процессов азотистого обмена в различных условиях инкубации свежеизолированных клеток печени свидетельствует о возможности коррекции как скорости деградации, так и скорости синтеза белка в эксперименте. Следует учитывать, что регулирующее влияние аммония на скорость деградации развивается в течение нескольких минут, глутамина — в течение 1ч, а смеси аминокислот — на протяжении нескольких часов.
