При выделении гепатоцитов экспериментатор преследует две основные цели:
- получить максимально большой их выход относительно исходного количества ткани;
- сохранить их морфологическую и функциональную интактности.
Именно эти два момента характеризуют эффективность любого способа диспергирования ткани.
Максимальная эффективность методов ограничена морфологическими особенностями самой печени.
У взрослых животных печень составляет, как правило, 2-4% от веса тела. У животных, растущих в течение всей жизни (рыбы, крысы), вес печени также перманентно увеличивается, так что сохраняется определенная пропорциональность (с тенденцией к уменьшению) относительного веса печени у старых животных. У животных, вес которых достигает к определенному возрасту максимального, вес печени с этого момента остается неизменным и составляет, например, у крысы около 4% от веса ее тела.
Индекс митотической активности клеток печени взрослых животных близок к нулю. У крыс, по данным разных авторов, он равен 0-0,4%. Это означает, что в нормальных физиологических условиях после дифференцировки клетки печени живут столько же, сколько и организм хозяина. Иначе говоря, возраст животного не влияет на число клеток печени. Однако, так как вес печени при этом возрастает, должны увеличиваться размеры клетки. Видимо, этим объясняются существенные различия в значениях объема клеток, полученных разными авторами.
Клетки печени организованы в лобулы, которые имеют в центре эфферентные венулы, а на периферии — портальные триады, состоящие из венул, артериол и желчных протоков. Все они тесно прилегают друг к другу. Паренхиматозные клетки расположены так, что они контактируют с тремя различными компартментами: околосинусоидальным пространством (37% поверхности клетки), желчными протоками (13% поверхности клетки) и соседними гепатоцитами (50% поверхности клетки). В соответствии с такой адатомией имеются два основных типа клеток: гепатоциты, или паренхиматозные клетки, и синусоидальные клетки. Гепатоциты составляют 90% от общего объема клеток, но только 65% от общего их числа. Это связано с тем, что паренхиматозные клетки значительно крупнее остальных. Их диаметр равен 25 мкм. Поэтому в весовом отношении они составляют до 10% от общей популяции клеток, что позволяет рассматривать последнюю практически как гомогенную и связывать особенности ее кетаболизма главным образом с паренхиматозными клетками. В последние годы, однако, стало ясно, что паренхиматозные клетки не образуют однородную популяцию, но имеют морфологию и ферментный состав, зависящий от их положения в лобулах. Например, околопортальные клетки меньше и имеют большее отношение ядро/цитоплазма, чем центролобулярные. Они богаче лизосомами, митохондриями и связанными энзимами. Центролобулярные клетки содержат больше гликолитических энзимов и ферментов окисления жирных кислот.
Второй тип клеток — это ретикулоэндотелиальные или купферовские клетки (макрофаги печени) и эндотелиальные клетки. Купферовские клетки широко используются в настоящее время для исследования процесса фагоцитоза в ткани, и их выделение представляет самостоятельную задачу.
После диспергирования печени получают первичную суспензию, которая представляет собой смесь паренхиматозных и непаренхиматозных клеток, что при современных способах выделения составляет 80-90% массы органа. Остальное — это соединительная и сосудистая ткань, которая удаляется. Дифференциальный подсчет клеток проводят, как правило, рунным методом по окрашиванию трипановым синим.
По данным большинства работ удается получать первичную суспензию, в которой от 90 до 98% клеток не окрашены трипановым синим. Однако выход клеток и их интактность существенно зависят от способа их выделения. Механические и химические способы диспергирования ткани позволяли получать в отдельных случаях сравнительно большое количество клеток, но все они имели разрушенные мембраны и полностью прокрашивались трипановым синим. Замечено также, что при использовании энзиматических способов диспергирования ткани только коллагеназа обеспечивает максимально большой выход клеток и высокий процент их непрокрашиваемости (более 90%). Перфузионный метод с применением коллагеназы дает существенно больший выход клеток, чем неперфузионный, но количество поврежденных гепатоцитов (по окраске трипановым синим) в обоих случаях примерно одинаково. И хотя гиалуронидаза не используется в настоящее время большинством исследователей, ее присутствие в растворе с коллагеназой увеличивает выход клеток на 60%.
Как уже говорилось, степень дисперсии ткани и получаемое количество клеток зависят от активности фермента, качества и продолжительности перфузии и других деталей процедуры выделения. Наряду с этим существенное значение имеют индивидуальные различия между животными, диета, время года и пр. Так, например, выход клеток из печени мелких животных меньше, чем из печени крупных, и у молодых на 20-30% меньше, чем у старых.
Гепатоциты в первичной суспензии имеют скорее неправильную форму, что отражает, по-видимому, их истинную геометрию. Так как значительная часть гепатоцитов — это диплоидные, и даже полиплоидные клетки, они имеют глубокую разделительную борозду на поверхности, заметную в световом микроскопе, которая может осложнять счет клеток. В процессе инкубации гепатоциты становятся выпуклокруглыми.
В результате очистки суспензии происходит отделение парехиматозных клеток от других типов клеток, клеточных агрегатов, кусочков соединительной ткани и сосудов, а также субклеточных осколков. Конечная суспензия клеток используется для эксперимента. Масса оставшихся в ней клеток соответствует примерно 30-40% от начального сырого веса ткани. Непаренхиматозные клетки составляют всего 1-2%. Паренхиматозные клетки не должны на 90-95% окрашиваться трипановым синим.
