Инкубирование изолированных гепатоцитов

Условия инкубирования очищенной и отмытой суспензии гепа­тоцитов непрерывно совершенствуются. Тем не менее к настоящему времени сложился ряд общих приемов, обеспечивающих в течение достаточно длительного времени (не менее 2ч) сохранение метаболических свойств гепатоцитов на сравнительно высоком уровне. Они сводятся к подбору адекватных сред инкубации, условий оксигенации, температурного режима и техники инкубирования.

Состав сред инкубации подбирается в соответствии с теми же соображениями, что и для перфузии и диспергирования. В качестве основы используются стандартные солевые среды. Напомним, что не рекомендуется применять фосфатный буфер, хотя неорганический фосфат включается в со­став сред инкубации.

Сохранение функционально-метаболических свойств изолиро­ванных клеток в процессе инкубации является предметом особого внимания исследователей. Накопленный опыт свидетельствует, что плазматическая мембрана гепатоцитов, использующих эндогенные субстраты, сохраняется интактной в течение 1-2 часов инкубации в минимально сбалансированных солевых буферных средах. Внутриклеточное содержание АТФ в этих условиях снижается довольно медленно. В то же время показано, что для сохранения специфических функций гепатоцитов в течение длительного времени (3-6ч) в среду необходимо вводить дополнительные компоненты.

Ряд лабораторий, получающих интактные и метаболически активные гепатоциты, используют различные варианты сред, содержащих некоторые углеводные субстраты, аминокислоты, гормоны и антибиотики. В качестве основы часто применяется субстратсодержащая среда Уаймауфа. Использование субстратов в инкубационной среде определяется прежде всего кругом научных задач, которые решаются в данных экспериментальных условиях.

Так, например, чтобы затормозить распад гликогена и подавить активность глюконеогенеза в истощенных по субстратам гепатоцитах, к средам инкубации добавляют глюкозу. При необходимости активации глюконеогенеза, наоборот, желательно включение в со­став сред лактата, пирувата, а также жирных кислот (например, олеата), но не субстратов ЦТК. Для ини­циации синтеза мочевины требуется NH₄Cl в сочетании с жирными кислотами и т.д.

Не рекомендуется включать в среды инкубации интермедиаты ЦТК, так как показана быстрая потеря жизнеспособности клеток в их присутствии. Выраженное отрицательное влияние на жиз­неспособность клеток имеет сукцинат, хотя в присутствии различ­ных других субстратов его действие может несколько меняться.

Поиск адекватных сред для поддержания в течение длительного времени жизнеспособности изолированных гепатоцитов, сохранения в них белкового синтеза, энергетического статуса и специфических метаболических процессов является самостоятельной проблемой. Эти вопросы будут рассмотрены в последующих разделах.

В период инкубации изолированных гепатоцитов сохраняются требования к высокой буферной емкости сред, начальное pH кото­рых, учитывая их быстрое закисление в присутствии метаболизирующих клеток, задается равным 7,6-7,5. Для повышения буферной емкости среды инкубации, используемой для продолжительно­го хранения клеток (более 1ч), рекомендуется в сбалансированную солевую среду вводить органический буфер типа ГЕПЕС (20-40мМ). В качестве основного по-прежнему используют бикарбонатный буфер в связи с тем, что в клетках печени существует несколько метаболических систем, использующих карбонат в биосинтетических целях. Причем при их интенсификации эндогенных его количеств недостаточно и возникает необходимость добавления в инкубационную среду экзогенного НСО₃.

Включение заменителей плазмы крови в состав инкубационных сред, по-видимому, обязательно. Наиболее часто для этих целей используют альбумин. В его отсутствии происходит быстрая агрега­ция клеток. Добавление альбумина обеспечивает более высокий уровень дыхания гепатоцитов. Он стабилизирует клеточную мембрану, создает необходимое осмотическое давление, предохранит мембранные белки. Альбумин связывает также жирные кислоты и билирубин, высокие концентрации которых токсичны для клеток. Поэтому его присутствие в инкубационной среде жела­тельно, чтобы исключить побочные токсические эффекты. Кроме того, присутствие альбумина в среде инкубации предотвращает из­быточную секрецию гепатоцитами в окружающую среду липопротеидных комплексов очень низкой плотности и тем самым снижает чрезмерную биосинтетическую активность изолированных клеток, приближая ее к состоянию in vivo.

В литературе приводятся данные о применении самых различных концентраций альбумина для сред инкубации: от 0,1 до 4%. Опыт работы показывает, что наилучшие резуль­таты достигаются при использовании 1%-ного раствора альбумина. Альбумин исключается из состава сред инкубации в специальных случаях, например при изучении окисления жирных кислот или кетогенеза в гепатоцитах.

Имеются сообщения об использовании вместо альбумина желатина. Тем не менее в ряде исследований, в которых были получены гепатоциты с хорошими метаболическими показателями, ни альбумин, ни его заменители не применялись.

Попытка добавления в инкубационную среду сыворотки крови была сделана очень давно. При этом было показано, что гепатоциты, помещенные в среду, содержащую сыворотку лошади, крайне быстро (в течение нескольких минут) агглютинируют, если эту сы­воротку не подвергнуть предварительной термообработке при 58°С. Этого не наблюдается при использовании сыворотки цыпленка, хотя в присутствии последней появляются некоторые нетипичные для клеток печени метаболиты.

В 100%-ной сыворотке крыс гепатоциты дышат в 2 раза интен­сивнее, чем в растворе Хенкса. Стимулирующий агрегацию эффект сыворотки связывают с ее ролью в образовании клеточных контактов, которые, как известно, не формируются в погибающих клетках.

Добавление сыворотки цыпленка к среде, в которой инку­бировались изолированные гепатоциты, стабилизировало внутри­клеточный уровень АТФ на протяжении многих часов, снижало потери белка, подавляло аутолиз клеток, обеспечивало в течение длительного времени высокий стационарный уровень синтеза бел­ков. Сыворотка стабилизировала плазматическую мембрану, благодаря чему отсутствовала потеря ферментов цитозоля во времени и поддерживались высокие значения потенциала К⁺. Наряду с этим она увеличивала чувствительность глюконеогенеза в изолирован­ных гепатоцитах к глюкагону и инсулину, т.е. положительно дей­ствовала на гормональную рецепцию клетки. Так как все эти свойства сыворотки сохранялись после диализа, предполагается, что стабилизирующим фактором является высокомолекулярный ее компонент, прочно связанный с сывороточными белками.

Несмотря на все эти свидетельства о положительном влиянии сыворотки на жизнеспособность изолированных гепатоцитов, во­прос о необходимости ее использования на этапе инкубации клеток остается открытым.

Условия оксигенации при инкубации изолированных гепатоцитов являются принципиальным моментом, от которого зависит в значительной степени длительность сохранения жизнеспособности клеток и их метаболических свойств. Клетки, инкубированные в средах, насыщенных по воздуху, быстро теряют АТФ. Поэто­му в методических руководствах по выделению гепатоцитов реко­мендуется насыщать инкубационные среды кислородом.

Инкубацию гепатоцитов, как правило, проводят в среде, насы­щенной карбогеном. Колбы с суспензией аэрируют газовой смесью и закрывают парафилмом. Не следует допускать появления воздушных пузырей в инкубационной суспензии, так как это ведет к повреждению клеток при испарении раствора.

До самого последнего времени существуют противоречивые мне­ния относительно оптимального температурного режима инкубации суспензии гепатоцитов.

В ранних работах практиковалось хранение суспензии гепато­цитов при низких (+2°) температурах. По данным Кребса, если толщина суспензионного слоя не превышает 2см, в этих ус­ловиях в течение 4ч сохраняется постоянным pH и оксигенация адекватна без шейкирования.

Тем не менее в подавляющем большинстве работ при инкубации клеток используется температура 37° и только в специальных слу­чаях, например при изучении транспорта ионов, — температура, близкая к нулю. Это связано с тем, что переход от низких темпера­тур к физиологическим и, наоборот, не безразличен для клетки, так как плазматические мембраны и внутриклеточные мембранные об­разования чувствительны не только к замораживанию, но и к ох­лаждению. Показано, что основным криоповреждающим фактором при охлаждении являются ослабление гидрофобных взаимодейст­вий в мембранах и внутриклеточная гипоксия, наступающая вслед­ствие замедления процессов внутриклеточного транспорта. Гипоксия может опосредованно привести к развитию ряда патоло­гических процессов в клетке, в том числе к активации перекисного окисления липидов с последующим повреждением лизосомальных мембран, изменению ионного состава гиалоплазмы и т.д.

Кроме того, хорошо известны изменения ионного состава клетки при низких температурах, выражающиеся в обращении потока ионов (увеличение в клетке при 0° содержания натрия и кальция и снижение содержания калия). Это состояние сходно с анаэробным шоком. Оно носит обратимый характер, если время экспозиции на холоде не превышает 1-2ч, после чего начи­нается развитие аутолитических процессов.

После очистки и отмывки первичной суспензии гепатоцитов по­лучают конечную суспензию, объем которой доводят до 70-100мл с таким расчетом, чтобы получить оптимальную концентрацию 1,0 - 3,0х10⁶ клеток/мл. Такая суспензия удобна для дальнейших био­физических и биохимических исследований. В коротких эксперимен­тах клетки инкубируют в стеклянных сосудах небольших объемов 25 см³ типа колб Эрленмейера, которые силиконизируют для снижения агрегации клеток на поверхности стекла. Цилиндрические сосуды неудобны из-за сильного испарения в них инкубационной жидкости. Оптимальное соотношение объема суспензии клеток к объему колбы приблизительно равно 1:10.

Для улучшения оксигенации и предотвращения быстрой реагре­гации гепатоцитов необходимо достаточно интенсивное перемеши­вание суспензии. Это лучше всего делать на ротерном шейкере при частоте 70-150 колебаний/мин. Наклон оси колбы к поверхности клеточной суспензии и инкубационной среде составляет 45-60°. При длительном инкубировании гепатоцитов (более 2 часов) необходи­мо более мягкое перемешивание во избежание механического по­вреждения клеток и сохранения их структурной интактности. Час­тота перемешивания не должна превышать тогда 20-30 колебаний/мин. Клетки с неповрежденными мембранами при пра­вильно подобранных условиях инкубации можно использовать в течение длительного времени (до 8ч). Через 2-3 часа после начала инкубации вначале небольшие клеточные агрегаты могут формиро­вать крупные образования в виде тяжей.

Согласно нашим данным, для предотвращения ранней реагрега­ции клеток целесообразно вносить в среду инкубации Са²⁺ в кон­центрации 0,5-1мМ. Дивалентные ионы оказывают регулирующее действие на адгезионные свойства гепатоцитов.

Если в процессе инкубации не произошло повреждения плазма­тической мембраны гепатоцитов, мелкие (до 10-20 клеток) агрега­ты легко разбиваются при фильтровании. При этом правильная, характерная для интактных клеток форма сохраняется. При необратимых повреждениях мембраны интенсивная реагрегация клеток и образование тяжей наблюдаются уже к концу первого часа инку­бации. Число клеток в агрегате может достигать нескольких десят­ков тысяч. Перемешивание или фильтрация такого сгустка не обеспечивают дезагрегацию: тяжи остаются на фильтре. Скорость реагрегации увеличивается примерно вдвое с ростом температуры инкубации от 22 до 37°С.

Описание особенностей и рекомендации для работы с изолиро­ванными клетками печени, хотя и включают в себя наиболее при­знанные и отработанные приемы, тем не менее не всегда обязатель­ны. Так, в самое последнее время вместо описанного способа инкубации клеток была применена иммобилизация гепатоцитов в геле. Это открывает дополнительные возможности, основанные на применении несложной техники многоканальной перфузии. Главная трудность при этом состоит в сохранении интактности гепатоцитов при непрерывном смывании клеток в геле сефадекса. Преимуществом же этого способа является то, что инкубация позволяла поддерживать необходимый уровень субстратов и продуктов метаболизма постоянными. При многоканальной перфузии появляется возможность (используя иммобилизованные ферменты или гормоны) изучать действие нескольких факторов на одном и том же клеточном препарате.