Для получения суспензии жизнеспособных гепатоцитов необходим правильный подбор диспергирующих условий, одним из которых является декальцинация. Удаление ионов кальция на первом этапе перфузии является существенным условием успешного диспергирования ткани печени. По данным Сеглена, замена раствора Рингера на среду Хенкса без кальция в этот период увеличивает выход клеток более чем в 5 раз.
Очень часто для более полного удаления ионов кальция из клеток в состав среды первого этапа перфузии включают хелатор кальция ЭГТА. Согласно некоторым опытам ЭГТА, если и не увеличивает выход клеток при прочих оптимальных условиях их выделения, то по крайней мере заметно снижает механические усилия, применяемые при диспергировании ткани.
Эффект вымывания кальция необратимо связан, видимо, с некоторыми конформационными изменениями во внеклеточном матриксе, которым способствует удаление «фактора адгезии клеток»: в отсутствии последнего улучшается дисперсия ткани. Минимальная концентрация кальция в перфузате, способная подавить диспергирование, не определена, но, видимо, очень низка. Дисперсию могут ингибировать даже те следовые количества кальция, которые высвобождаются из ткани в перфузат. Это действие оказывают любые концентрации экзогенного кальция.
На втором этапе перфузии введение в среду, содержащую коллагеназу, ионов кальция, необходимых для активации фермента, не сказывается восстанавливающим образом на состоянии межклеточных контактов и не приводит к обращению эффекта от перфузии бескальциевым солевым раствором. В то же время добавление кальция в этот период (оно не должно быть слишком ранним) благотворно влияет на состояние плазматической мембраны и тем самым на метаболические свойства выделенных гепатоцитов. Концентрация кальция в используемых средах колеблется от 0,5 до 5мМ. Наиболее часто применяют раствор, содержащий 1-2мМ кальция. В больших концентрациях (больше 6мМ) кальций ингибирует набухание печени.
Действие кальция ионспецифично. Сеглен указывает, что магниевые соли оказывают ингибирующее действие на процесс набухания печени, если они введены в отсутствие кальция. При одновременном применении кальция и магния ингибирующее действие не наблюдается. Многие авторы включают поэтому магний в состав среды перфузата.
Следует учитывать, однако, что отсутствие кальция в среде выделения и хелатирующие агенты могут давать побочные эффекты, сказывающиеся на метаболизме гепатоцита. Так, например, отсутствие Са2+ в среде изоляции вдвое увеличивает содержание Na+ в клетке, в 2 раза уменьшает концентрацию К+ в ней и на 38% уменьшает величину мембранного потенциала клетки. Считается возможным участие Са2+ в регуляции распределения анионных метаболитов между митохондриями и цитозольным компартментом, а также в метаболизме глюкозы. Поэтому поиск возможностей для оптимизации этапа бескальциевой перфузии печени остается актуальным.
Коллагеназа является единственным в настоящее время известным ферментативным препаратом, обеспечивающим при адекватных режимах выделения получение морфологически и метаболически полноценных клеток. Ранее этот фермент применялся вместе с гиалуронидазой, которая и сейчас еще успешно используется для выделения эпителиальных клеток и адипоцитов. Однако, по мнению ряда авторов, гиалуронидаза не оказывает заметного действия на процесс изоляции клеток печени и исключается поэтому из состава перфузатов. Сеглен показал, что в больших концентрациях гиалуронидаза может даже затормозить распад соединительной ткани (судя по торможению набухания печени). Кроме того, она увеличивает деградацию гликогена.
Также не было найдено заметного влияния гиалуронидазы на качество диспергирования клеток печени в диапазоне концентрации — 10-1000мг на 100мл. При высоких концентрациях фермента становится выраженным его протеолитическое действие. Следует, тем не менее, отметить, что присутствие гиалуронидазы в среде выделения вместе с коллагеназой, по некоторым данным, увеличивает выход клеток на 1г ткани. Одна гиалуронидаза никогда не используется для диспергирования печени.
Не принесло успеха применение и других ферментов, используемых в качестве разрушителей межклеточного цемента, например трипсина. Его протеолитическое действие оказалось слишком высоким, и он необратимо разрушал плазматические мембраны. По многим данным его использование даже в очень низких концентрациях (0,001%) несовместимо с получением интактных клеток. Неэффективными оказались попытки использовать диспазу и лизосомальные ферменты.
Успешное диспергирование печени зависит, прежде всего, от качества используемой коллагеназы. Однако на сегодняшний день нет критериев, которые бы однозначно оценивали ее диспергирующие свойства. Различные фирмы изготовляют фермент с нестабильными свойствами, что требует подбора рабочих концентраций фермента для каждой партии препарата. Наибольший выход неповрежденных клеток получают при использовании коллагеназы фирм Уортингтон и Бёрингер.
Всем ферментативным препаратам в какой-то мере присуща протеолитическая активность, повреждающая мембраны клеток. Именно она накладывает ограничения на время перфузии печени ферментсодержащим раствором. Из-за высокой протеолитической активности не рекомендуется применение высокоочищенной коллагеназы. По-видимому, существуют генетические различия в чувствительности животных к ее протеолитической активности. Поэтому предпочтительно использование линейных животных.
Специфическая активность фермента, колеблющаяся в пределах 100-200ед/мл, слабо связана с его диспергирующей способностью и не может служить критерием при сравнении препаратов разных фирм.
Концентрация фермента в перфузате может колебаться от 0,01 до 0,25%. Ряд исследователей считает оптимальной концентрацию, равную 0,03%. Наилучшие результаты получают с препаратом коллагеназы в присутствии кальция, который ее активирует, и при оптимальной для нее температуре 37°С.
Успех эксперимента по диспергированию печени не только зависит от концентрации фермента, но и во многом определяется временем ферментативной перфузии печени, которое подбирается эмпирически. При недостаточно длительном контакте ткани с раствором коллагеназы (или в случае низкой ее концентрации) межклеточные контакты полностью не разрушаются и излишние механические усилия, прикладываемые в момент диспергирования, повреждают клетки. Нам приходилось сталкиваться со случаями, иногда при сохранении высокой специфической активности после длительного хранения диспергирующая способность фермента резко уменьшалась, в отличие от протеолитической (неповрежденными оставалось только 20-50% гепатоцитов). Подобные факты отмечались ранее и другими исследователями.
Как уже отмечалось выше, изменение температурного режима перфузии и использование этого при диспергировании печени вместо охлажденных растворов (20-22° или даже 2-4°) при температуре 37°С позволили резко увеличить общий выход клеток. Это связано прежде всего с тем, что именно при физиологической температуре проявляется оптимальная активность коллагеназы. Таким образом, выбор температуры перфузии печени решается в настоящее время однозначно. Следует также еще раз обратить внимание на то, что клетки печени сохраняют высокую метаболическую активность во время перфузии, которая находится в тесной и прямой зависимости от температурного режима. Ее изменение под влиянием различных факторов, в том числе температурного, может кардинальным образом повлиять на метаболический статус изолированных гепатоцитов.
Постперфузионная техника получения гепатоцитов и условия сохранения их жизнедеятельности
По завершении двух этапов перфузии печени ткань находится в таком состоянии, когда межклеточные связи максимально разрушены. Тем не менее для окончательного ее диспергирования необходимо минимальное механическое воздействие. Для этого печень переносят из перфузионной камеры в пластиковую чашку Петри диаметром 100-150мм, капсулу, покрывающую печеночные доли, разрывают и ткань механически измельчают. Практически, каждый экспериментатор вырабатывает свои приемы мягкого ее диспергирования: с помощью острия ножниц, пластикового или металлического гребня, путем шпателирования либо, наконец, отжатием в марле. При удачно проведенной процедуре перфузии печень очень быстро распадается на клетки, обнажая строму белого цвета.
В отдельных случаях интенсивное встряхивание может способствовать диспергированию печени на клетки, хотя некоторые исследователи не рекомендуют этого делать, так как получение суспензии с интактными клетками требует очень осторожных мягких механических манипуляций. Показано, что даже небольшое сдавливание ткани увеличивает количество клеток с поврежденной мембраной. Именно этот этап определяет состояние мембран изолированных гепатоцитов.
Очень часто сразу же после диспергирования печени применяют перемешивание тканевой суспензии на шейкере. Это позволяет освободиться от крупных клеточных агрегатов, осколков, легких частиц ткани и т.п. Однако эта процедура увеличивает продолжительность периода от начала диспергирования печени до момента окончательной отмывки клеток и повышает, таким образом, вероятность повреждения клеток продуктами распада.
Сразу же после диспергирования или через 8-10мин инкубации на шейкере полученную первичную клеточную суспензию дважды фильтруют, используя различные фильтры: диаметром 100-150мкм для первой фильтрации и 61-65мкм — для второй. Двухступенчатая фильтрация служит для постепенного и последовательного удаления агрегатов и тканевых фрагментов без применения давления, которое способствует механическому повреждению клеток. Для этих же целей применяют плоскодонные фильтры специальной конструкции. Конечная суспензия содержит единичные клетки и небольшие агрегаты из 2-3 клеток.
Следующий этап очистки первичной суспензии — это отделение интактных паренхиматозных клеток от поврежденных и от клеток других типов. Непаренхиматозные клетки, так же как и гепатоциты с разрушенными плазматическими мембранами, значительно легче, чем неповрежденные гепатоциты. Поэтому они могут быть удалены центрифугированием. Клетки седиментируют при низких скоростях (50g) 3-4 раза: в первый раз — 2 минуты, в остальных случаях — по 1 минуте.
Супернатант каждый раз отсасывают пипеткой, осадок осторожно ресуспендируют в свежем растворе до прежнего объема и снова центрифугируют. С увеличением числа оборотов растет количество осажденных клеток, но одновременно увеличивается и степень «загрязненности» суспензии. Известны примеры более мягкого центрифугирования (30g/40с), которое обеспечивает, тем не менее, достаточный в количественном отношении выход клеток, и позволяет при этом избавиться от непаренхиматозных клеток.
Центрифугирование можно заменить гравитационным осаждением в течение 3-4 мин. Не дожидаясь появления четкой границы между клетками и отмывающим раствором, надосадок осторожно удаляют, ресуспендируют и повторяют эту операцию дважды. Эта процедура минимально повреждает клетки печени, но время отмывки при этом увеличивается до 15-18мин. Применение любых способов, включающих фильтрацию под отрицательным давлением, исключено, так как это ведет к резкому увеличению количества разрушенных клеток. Так как плотность суспензии клеток, имеющих поврежденную мембрану, несколько меньше плотности суспензии интактных клеток, а в процессе короткой преинкубации это отличие усиливается из-за выхода через разрушенную мембрану ряда цитоплазматических субстанций в среду инкубации, Сеглен предложил процедуру получения очень «чистой» фракции изолированных гепатоцитов при центрифугировании в градиенте плотности с использованием метризамида.
Отмывку клеточной суспензии от метаболических загрязнений проводят не менее трех раз. При этом следует иметь в виду, что в процессе отмывки гепатоциты теряют некоторые свойства, присущие клеткам печени в первичной суспензии. Так, например, существенно уменьшается их эндогенное дыхание. Тем не менее в некоторых специальных случаях требуется очень тщательная отмывка клеток, например для удаления жировых частиц из суспензии изолированных клеток печени крыс после искусственной гиперхолестеролемии отмывку проводят 6 раз.
Очистка и отмывка гепатоцитов производятся в солевых растворах, выбираемых по тому же принципу, что и для перфузии печени. Однако кальций обязательно входит в их состав. Так же как и на 2-м этапе перфузирования, в этот период он уже не влияет на адгезионные свойства клеток, но благотворно сказывается на состоянии плазматических мембран, уплотняя их.
В отличие от предшествующего этапа все процедуры данного периода рекомендуется проводить при низких температурах (+4°-0°). Это необходимо прежде всего для того, чтобы снизить до минимума внутриклеточные метаболические процессы и благодаря этому уменьшить чувствительность гепатоцитов к стрессовым воздействиям, главным из которых является центрифугирование. Низкая температура снижает способность клеток к реагрегации и образованию сгустков или тяжей.
Этому же помогает добавление в отмывающие растворы бычьего альбумина (1,0%) или бычьей сыворотки. Оба эти компонента, повышая вязкость среды, защищают клетки от механических разрушений при центрифугировании и, видимо, существенно не влияют на основные метаболические свойства гепатоцитов: дыхание, глюконеогенез и синтез мочевины. При отсутствии альбумина может возникнуть быстрая, почти мгновенная агглютинация гепатоцитов при ресуспендировании.
