Перфузия печени и все необходимые процедуры, вплоть до диспергирования ткани на клетки, производятся in situ на наркотизированном животном. Тип наркоза (при соблюдении всех остальных необходимых процедур) не влияет на количество и качество выделенных клеток. Однако следует учитывать, что слишком глубокий эфирный наркоз или длительная остановка кровотока при канюлировании v. portae могут привести к сосудистому коллапсу и резкому ухудшению качества перфузии. Гепатическая вазоконстрикция может быть индуцирована катехоламинами, выбрасываемыми в кровь животных в фазе наркотического возбуждения. Поэтому Сеглен рекомендует конструкцию камеры, обеспечивающей постепенное поступление летучих наркотических веществ сверху. Это смягчает фазу наркотического возбуждения у животных и положительно влияет на последующий процесс диспергирования ткани.
Операционная техника. Техника перфузии, впервые предложенная Миллером, в настоящее время достаточно хорошо отработана. Брюшную полость наркотизированного животного вскрывают, в нижнюю полую вену или брыжейку тонкого кишечника вводят гепарин (500ед/мл), подводят лигатуры под v. portae, захватывая a. hepatica propria и под v. cava inf., выше v. renalis dextra. Через 1мин после введения гепарина надсекают v. portae в мезентериальной части и немедленно ее канюлируют. Канюлю укрепляют зажимом дистальнее 1-й бифуркации v. portae и сразу же надсекают v. cava inf., чтобы избежать набухания печени. Затем канюлю фиксируют двумя лигатурами. В v. cava inf. вставляют капилляр диаметром 1,7мм. После этого вскрывают диафрагму, под V. cava sup. подводят лигатуру, которую перевязывают или вставляют в нее канюлю.
Наш опыт не позволяет рекомендовать перфузию печени, полученной от декапитированных животных, так как в этом случае, даже если и удается получить изолированные гепатоциты с неповрежденными мембранами, они содержат лишь следы АТФ, что говорит о выраженных катаболических процессах в них.
Естественные изменения в технике операции возникают тогда, когда имеют дело с таким объектом, как печень цыплят, у которых нет диафрагмы, рыб или при получении клеток печени очень молодых животных. В последнем случае обычная процедура оперирования затруднена из-за мелких размеров сосудов. Поэтому ввод перфузата осуществляют через предсердие, отток — через v. portae (v. cava inf. перевязывают проксимальнее сосудистой ножки правой почки).
Для канюлирования сосудов при перфузии можно использовать как стандартные стальные иглы, на которых удобно сделать насечки для крепления лигатуры, так и пластиковые катетеры диаметром около 2мм. Чтобы исключить попадание пузырей в сосудистую систему печени, сток перфузата через канюлю начинается за 20-30с до канюлирования. В литературе описаны разнообразные конструкции и устройства для проведения перфузии.
Перфузия печени. Выбор адекватных режимов и продолжительности перфузии являются одним из определяющих факторов получения качественных гепатоцитов. Целью 1-го этапа являются отмывка печени от крови и частичное ослабление межклеточных контактов путем удаления кальция. Для этой цели применяется нерециркуляторная перфузия.
Бескальциевый и/или ЭГТА-содержащий раствор пропускается скоростью 15-20мл/мин. Скорость потока не может быть слишком высокой, так как последнее способствует патологическому набуханию печени и разрушению клеток, особенно в бескальциевой среде. Стабильность скорости потока перфузата имеет очень большое значение для обеспечения равномерного снабжения всех участков печени коллагеназой. Поэтому факторы, нарушающие его, должны быть устранены (закупорка печеночных венул твердыми частицами, либо микроскопическими пузырьками, выделяющимися при пробулькивании 5%-ного СО2, либо за счет нерегулярного потока в перфузионной цепи). Целесообразно вводить в систему фильтр — газоуловитель. Свидетельством правильного хода отмывки служат очень быстрое, равномерное по всей поверхности осветление печени и отсутствие мозаичных пятен бурокоричневого цвета, из которых не была удалена кровь при неравномерном потоке перфузата. Следовательно, в этом случае имеются предпосылки для неадекватного их снабжения энзимом. Такие участки являются источником клеток с поврежденными плазматическими мембранами и повышенной способностью к слипанию. Эти включения должны быть устранены очень мягким массажем.
В ранних работах время перфузии бескальциевой средой составляло 15-20мин. Эмпирически накопленный опыт показал, что оно может быть уменьшено до 7-8мин без отрицательного влияния на качество получаемых клеток. Объем перфузата, используемый на этапе нерециркуляторного режима, составляет 200-300мл.
На 2-м этапе перфузию печени проводят фермент- и Са-содержащим раствором с целью окончательного разрушения межклеточного цемента. Ради экономии фермента цепь перфузии замыкают (рециркуляторная перфузия). Незамкнутая система перфузии может быть сохранена при работе с мелкими животными, когда для диспергирования печени даже в таких условиях достаточно небольших (200мл) количеств перфузата, протекающего со скоростью 10мл/мин.
Замкнутую перфузию 2-го этапа можно проводить in situ. Однако, как правило, перфузируемую печень экстирпируют и всю последующую процедуру осуществляют в перфузионной камере, т.е. в условиях in vitro. Оптимальный режим подачи перфузата обеспечивается при скорости 25-35мл/мин и давлении 10-20мм водяного столба. При этом для создания нужного давления в сосудистом русле обязательно должно иметь место небольшое набухание печени. Время, в течение которого печень омывается содержащим фермент перфузатом, определяется активностью последнего.
Через 3-5мин после перфузии печени раствором коллагеназы поверхность печени приобретает специфический вид: становится заметна сетчатая микроструктура ткани. При мягком надавливании кончиком пластиковой трубки на поверхность печени можно увидеть медленно исчезающий след. Еще через 4-7мин подобная манипуляция приводит к появлению рваного отверстия, из которого, как это легко заметить, происходит вытекание перфузата. Это — признак завершения диспергирования ткани. Другим эмпирическим признаком являются истончение острых краев отдельных долек, появление некоторой их прозрачности и заметное увеличение количества перфузата, выступающего на поверхности печени.
Момент полного разрушения межклеточных контактов сопровождается заметным уменьшением объемной скорости перфузата из канюли, введенной в v. cava inf. Это обстоятельство может быть использовано для объективной оценки диспергирования ткани и ее готовности к механическому разделению клеток, так как с уменьшением количества жидкости, прошедшей через сосуды печени, уменьшается и количество кислорода, потребляемого органом за единицу времени. Увеличение стационарной концентрации О2 или уменьшение разницы по О2 между притекающим и оттекающим перфузатом указывают на завершение процесса ферментативного разрушения соединительной ткани. В этот момент часто наблюдается сплющивание печени.
Сеглен отмечает, что при правильно проведенной перфузии к моменту ее завершения объем печени увеличивается примерно вдвое из-за набухания. Показателем завершения диспергирования ткани могут быть также изменения температуры поверхности перфузируемой печени. Однако опыт показывает, что совокупность внешних признаков не может в настоящее время быть стандартизована для оценки степени разрушения межклеточных контактов и определяется самим экспериментатором.
Общее время реперфузии с ферментсодержащим раствором, указываемое в последних работах, не превышает 15-20мин. В некоторых экспериментах при использовании свежей коллагеназы фирмы Уортингтон оно составляло 6-7мин.
Имеются модификации перфузии печени, основанные на изменении направления потока перфузата спустя некоторое время (10-15мин) после начала 2-го этапа. Целью этого приема является уменьшение изменений, вызванных частичным разрушением сосудистой стенки в районе входа перфузионного потока через v. portae. При этом он направляется через v. cava sup. и выходит через v. portae. Нижнюю полую вену перевязывают. Однако практика работы показала, что такая процедура может быть опущена без ущерба для качества полученных клеток.
Следует, однако, отметить, что можно проводить диспергирование ткани неперфузионным методом. При этом сохраняется обязательная преперфузия печени бескальциевым раствором. Затем из печени приготовляют срезы толщиной не более 0,7мм, которые инкубируют в ферментсодержащих растворах. Такой способ дает меньший выход клеток, чем перфузионный (в 2-10 раз), но обеспечивает интактность их плазматических мембран.
Метаболические свойства гепатоцитов, выделенных энзиматическим способом из срезов, по данным одних авторов, слегка ухудшены по сравнению с клетками, полученными перфузионным спонсором, по другим данным — такие же. Благодаря наличию в суспензии таких клеток мембранных фрагментов, способствующих увеличению адгезии, гепатоциты, как правило, агрегированы и одиночные клетки единичны.
Тем не менее использование этого способа может иметь преимущества в определенных ситуациях, например при работе с биопсийным материалом или на мелких животных, когда невозможна перфузия печени.
Составы сред на этапе перфузии по своим свойствам должны приближаться к межклеточной жидкости, чтобы обеспечить максимальное сохранение метаболических свойств органа, присущих ему in vivo. Они должны обладать достаточным онкотическим давлением, необходимым ионным составом, обеспечивать поддержание физиологических значений pH, температуры, оксигенации и пр. При этом должны сохраняться условия для эффективного действия диспергирующих агентов.
Многочисленные работы подтверждают, что такие среды, как раствор Хенкса, Рингера, Кребс-Хенселейта, Тироде и другие, могут быть взяты за основу при выборе состава перфузата.
Наиболее адекватными являются бикарбонатные буферы, которые, однако, эффективны лишь при насыщении 5% СО2. Постоянство рСО2 среды выделения (или инкубации) существенно для глюконеогенеза из лактата, синтеза мочевины и для некоторых других функций гепатоцита. Смеси NaHCО3 и Na2CО3 обладают способностью поддерживать стационарный уровень рСО2 растворов и поэтому входят в состав многих буферов.
При подборе сред выделения следует учитывать, что, если плазматические мембраны гепатоцитов повреждены, как это имеет место при механическом или химическом способах выделения, некоторые их компоненты могут отрицательно сказаться на состоянии клеток. Показано, например, что высокие концентрации, сахарозы (более 0,25М) вызывают патологическое набухание внешней мембраны митохондрий аналогично тому, как это имеет место в изолированных митохондриях. Так же как и в митохондриях, кальций и ортофосфат ингибируют дыхание гепатоцитов с поврежденными мембранами.
Так как этап перфузии занимает около 60мин, в перфузирующие среды, как правило, не добавляют субстраты окисления. Отсутствие экзогенных субстратов в течение сравнительно короткого времени существенно не влияет на метаболические свойства ткани и гепатоцитов в последующем.
Исключением являются случаи, когда возникает необходимость предотвратить гликогенолиз в печени сытых животных, что достигается введением высоких концентраций глюкозы (20мМ) либо уменьшить потери глутатиоиа за счет добавления в среду метионина.
Буферная емкость среды имеет очень большое значение. Она должна быть очень высокой, так как метаболиты печени во время перфузии и инкубации срезов и изолированных клеток сильно сдвигают pH среды в кислую сторону, особенно в первые 10-15мин. Перечисленные выше среды и по составу и по соотношению ионов соответствуют межклеточной жидкости или плазме крови. При осмомолярности около 300мосМ они обеспечивают осмотическое давление порядка 7,7атм при 37°С.
Очень высокой буферной емкостью обладает бикарбонатный буфер в присутствии 5% СО2. Он позволяет надежно поддерживать pH среды в пределах 7,3-7,5. Поэтому в процессе выделения гепатоцитов перфузат обычно насыщают карбогеном. При перфузии печени взрослой крысы объем перфузата в замкнутой системе равен 100-200мл. Буферной емкости такой среды при использовании бикарбонатного буфера достаточно для поддержания pH в указанных пределах. Наш опыт показывает, однако, что при уменьшении объема перфузата до 50мл и ниже, когда из-за метаболитов печени возможность закисления среды резко увеличивается, целесообразно добавлять 10-20мМ органического буфера, с высокой буферной емкостью (HEPES, TES, Tricine).
Фосфатные буферы имеют низкую буферную емкость и к тому же подавляют реакции с участием бикарбоната (например, синтез мочевины и жирных кислот), поэтому они не используются при приготовлении сред выделения и инкубации.
Среды, содержащие растворимые белки плазмы, обладают очень высокой буферной емкостью, поэтому в состав перфузионных сред часто включается альбумин. Его роль, однако, заключается не только в улучшении буферных свойств. Будучи нейтральным относительно метаболизма печени, он увеличивает осмотическое давление и вязкость растворов и соответственно давление в перфузате, что в условиях субоптимальной скорости потока обеспечивает более равномерное распределение кислорода в перфузируемой печени. Кроме того, он уменьшает протеолитическое воздействие коллагеназы, предохраняя мембранные белки от протеаз. Обычно используемый 2%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина создает осмотическое давление около 0,1атм, что составляет менее 0,2% давления неорганической компоненты перфузата.
В этой связи следует напомнить, что альбумин широко применяется при перфузии органов не только для создания достаточного онкотического давления, но и главным образом для предупреждения чрезмерного набухания ткани при осмотической трансфузии воды из русла сосудов в межклеточное пространство. Последнее может происходить потому, что стенки сосудов легко проницаемы для воды и солей, но не пропускают белковые молекулы. Ничего подобного не наблюдается при перфузии печени с целью дисперования гепатоцитов; под действием коллагеназы разрушается стенка сосудов, и перфузат непосредственно омывает мембраны клеток печени. Создание дополнительного онкотического давления в среде теряет свою актуальность.
Необходимо учитывать, что присутствие альбумина в среде выделения клеток вносит ряд отрицательных моментов. Из-за частичного связывания диспергирующего фермента с альбумином поздний снижает выход клеток и увеличивает их способность к агглютинации. Кроме того, из-за возросшей вязкости раствора в его присутствии возрастает опасность закупорки сосудов, и благодаря этому – ухудшения качества перфузии через мелкие капилляры.
Применение белкового раствора в качестве среды перфузии создает также дополнительные трудности при пропускании газовых смесей через раствор для создания достаточных рСО2 и рО2. Поэтому мы разделяем точку зрения большинства экспериментаторов, считающих нерациональным включение бычьего сывороточного альбумина в состав среды выделения при перфузии печени.
Закисление среды отрицательно сказывается на жизнедеятельности клеток печени, и pH не должен уменьшаться ниже 7,3, а начальные его значения с учетом последующего сдвига могут быть равны 7,6. В этом же диапазоне (рН=7,5) находится и оптимум активности коллагеназы, т.е. создаются условия для максимального набухания печени на этапе ферментативной перфузии. При pH среды выше 8,4 гепатоциты погибают.
Поддержание стационарного pH в перфузате может осуществляться автоматически непрерывным добавлением NaOH либо путем непрерывного газирования бикарбонатного буфера 5% СО2. Однако этот процесс может сопровождаться образованием и выпадением в осадок нерастворимых частиц, которые способны закупоривать венулы. Поэтому органические буферы с высокой буферной емкостью имеют серьезные преимущества для фактического использования (HEPES, TES, Tricine).
Замена одной буферной среды на другую производится, как правило, переключением перфузионных резервуаров в цепи рециркуляции. Некоторые авторы предпочитают перемещение препарата изолированной печени целиком в другую перфузионную камеру. Это технически несколько сложнее, но зато позволяет избежать перепадов при смене трубок и появления пузырей в соединительных шлангах.
Оксигенация сред выделения при перфузии печени является обязательным условием получения жизнеспособных и метаболически полноценных гепатоцитов. Так как рО2 в физиологических растворах при 37°С составляет примерно 200мкМ, полное его исчерпание произойдет примерно за 20мин, если не производить дополнительного насыщения кислородом перфузионных сред, а уже через 10мин клетки органа окажутся в гипоксических условиях. Эта ситуация была экспериментально продемонстрирована Берри и Френдом, которые показали, что если в условиях перфузионной системы концентрация кислорода в притекающем перфузате была равна 315мкМ, то на выходе она составляла не более 125мкМ. При насыщении исходного раствора кислородом до 600мкМ его концентрация в оттекающем перфузате падала менее чем за 30 минут до 300мкМ.
Высокая скорость дыхания перфузируемой печени требует поддержания соответственно высокой концентрации кислорода в перфузате. Как правило, для его насыщения до 500-700мкМ используют карбоген (95% О2 + 5% СО2), который пропускают через раствор в течение 10-15мин. Тем не менее Сеглен считает, что короткий период гипоксии (до 30мин) не вносит необратимых нарушений в метаболизм печени: дыхание печени полностью восстанавливается в период реоксигенации и клеточные препараты сохраняют свою жизнеспособность. Поэтому перфузионная оксигенация карбогеном заменяется иногда обработкой газовой смесью (воздух + 5% СО2) в присутствии органических буферов.
Однако постепенно накапливаются данные о том, что если барботирование такой газовой смесью и не приводит к увеличению количества поврежденных клеток, оно сказывается на метаболической активности гепатоцитов, в частности – на скорости синтеза в них альбумина и на скорости образования глюкозы из лактата, что связано с гипоксией, развивающейся в этих условиях. Клетки, полученные при такой перфузии, имеют некоторые морфологические аномальности, обнаруживаемые с помощью электронной микроскопии (вакуоляризация цитозоля и эндоплазматического ретикулума, сокращение митохондриального матрикса). Хотя эти изменения обратимы, оксигенация перфузата воздухом, видимо, недостаточна для создания оптимальных условий переживания клеток.
Высокие требования к оксигенации предъявляются и при выделении гепатоцитов из срезов. Среды, используемые при этом, должны быть насыщены кислородом, иначе наблюдаются потери гликогена клетками и их дегенерация.
