Фосфотриэстеразы (органофосфатгидролазы)

Интерес к этому классу ферментов, гидролизующих триэфиры (или их аналоги) фосфорной кислоты, в последнее десятилетие существенным образом возрос из-за их способности гидролизовать боевые отравляющие вещества (зарин, зоман, вигаз) и фосфорорганические пестициды.

Наиболее полно изучен фермент из почвенных бактерий Pseudomonas. Для этого фермента известна первичная, вторичная и пространственная структура. Поиск в геномных базах данных гомологов этого фермента позволил получить серию последовательностей аминокислот, обладающих высокой гомологией. Процедура поиска гомологов была проведена по всей совокупности расшифрованных последовательностей и геномов. Данный фермент имеет большое число родственников в биологическом мире, и его гомологи представлены в геномах бактерий, животных.

Большая часть обнаруженных последовательностей представлена в форме виртуального транслятора, т. е. лишь в виде последовательностей нуклеотидов в геномах, и не описана как физически выделенные и идентифицированные белки. Лишь для трех бактерий (Pseudomonas, Flavibacterium, Micobacteriumtuberalosis) экспериментально показано, что белки обладают фосфотриэстеразной активностью. Каталитический центр фермента образуют ионы Zn ⁺ или Со²⁺, объединенные в биядерный комплекс. «Сборку» биядерного комплекса осуществляет Lys-169 (нумерация дана по фосфотриэстеразе из бактерии Pseudomonas). Наличие этого остатка является необходимым для формирования каталитического центра, осуществляющего электрофильную активацию субстрата и электрофильную активацию воды. Большая часть белков, содержащих Lys-169, не описана как ферменты, обладающие фосфотриэстеразной активностью, однако с высокой степенью надежности можно прогнозировать ее наличие.

Центры связывания металла (His-55, His-57, Lys-169, His-201, His-230) в высшей степени консервативны. Также абсолютно необходимым является наличие в 56-м положении карбоксилсодержащей аминокислоты (допускается изоморфная замена глутаминовой кислоты на аспарагиновую). Важно отметить наличие консервативного Gly-229, помогающего каталитически важному остатку гистидина His-230.

«Гидрофобный карман», фиксирующий гидрофобные фрагменты субстрата — область также консервативная, ее образуют Leu-271, Leu-272, Trp-302, Leu-303, Phe-306, Met-317. Видно, что шесть алифатических и ароматических аминокислот образуют гидрофобную микрофазу, которая может эффективно экстрагировать и фиксировать алифатические фрагменты субстратов.

Аминоацил-тРНК-синтетазы. «Узнавание» аминокислот важно как на стадии деструкции — гидролиза белков, так и на стадии их синтеза. Ключевыми ферментами в синтезе белков, обеспечивающими соответствие между аминокислотой и соответствующим ей кодоном, являются аминоацил-тРНК-синтетазы. Эти ферменты относятся к классу синтетаз (6-й класс в классификации ферментов) и катализируют реакцию присоединения аминокислоты к тРНК с соответствующим кодоном.

Для каждой аминокислоты существует набор тРНК с соответствующими кодонами. Это ключевая реакция в биосинтезе белка, поскольку она является единственной в механизме биосинтеза, определяющей соответствие структуры аминокислоты и кодона. Специфичность аминоацил-тРНК-синтетазы достаточно высокая и определяется теми же кинетико-термодинамическими закономерностями и набором взаимодействий, что и в случае ферментов гидролиза белков.

Рассмотрим, как аминоацил-тРНК-синтетаза, специфичная по лизину и соответствующей тРНК, «узнает» аминокислоту лизин. Е-аминогруппа аминокислоты взаимодействует с карбоксильной группой Glu-428, образуя прочную ионную пару. Взаимодействие происходит в гидрофобной среде, образуемой ароматическими кольцами Phe-473 и Туг-280. А-аминогруппа субстрата также связана с карбоксильной группой GIu-278 за счет электростатических сил. Этот фрагмент субстрата является общим для всех аминокислот. Поэтому для любой аминоацил-тРНК-синтетазы вблизи заряженной аминогруппы можно обнаружить заряженную карбоксильную группу, осуществляющую электростатическое связывание фрагмента субстрата.

Таким образом, двухточечная фиксация аминокислоты электростатическими взаимодействиями обеспечивает расположение реакционноспособной карбоксильной группы в нужной области активного центра.

Специфичность действия является принципиально важным свойством ферментов, обеспечивающим возможность проведения химических реакций в биологических системах с наименьшими потерями. Для объяснения способности выбирать молекулы определенной структуры было создано несколько модельных представлений, каждое из которых нашло экспериментальное подтверждение. Количественное подтверждение получила двухцентровая модель, связывающая выбор субстрата со специфической фиксацией его сорбционным центром фермента. По-видимому, механизмы выбора субстрата многообразны и каждый вносит определенный вклад в специфичность действия фермента.

Главный вывод из изложенного заключается в том, что для обеспечения специфичности ферменты используют весь набор «слабых», но «быстрых» взаимодействий (образование водородных, гидрофобных связей, ионных пар) для фиксации фрагментов субстрата и ориентации его относительно каталитически активных групп, приближая структуру субстрата к структуре переходного состояния слабого взаимодействия (8 — 25 кДж/моль).

Важно отметить, что относительно небольшие изменения структуры сорбционного центра могут вызвать существенные изменения специфичности фермента. Так, всего лишь одна мутация — замена серина в 189-й позиции на аспарагиновую кислоту — обеспечивает перевод протеиназы из химотрипсинового ряда в трипсиновый.

Специфичность действия ферментов важна как в гидролитических, так и в синтетических реакциях. Особенно она существенна, когда ферменты участвуют в реакциях модификации генетического материала. На специфичности действия ферментов основана одна из самых интересных областей современной науки и технологии — генетическая инженерия.