Содержание адениннуклеотидов, отношение АТФ/АДФ и концентрация АТФ в изолированных гепатоцитах как критерии их жизнеспособности
Параметры адениловой системы используются различными авторами в качестве основного метаболического критерия функциональной полноценности и жизнеспособности этих клеток. Это и понятно, так как они являются ключевыми метаболитами, определяющими энергетический статус клетки. Способность сохранять в гепатоцитах высокие значения АТФ и отношение АТФ/АДФ используется многими исследователями в качестве критерия адекватно подобранных для них условий выделения и переживания. Этому способствует, например, внесение в инкубационную среду различных субстратов , сыворотки и пр. В таких условиях концентрация АТФ и отношение АТФ/АДФ в клетках могут даже увеличиваться во времени.
И, наоборот, деградация АТФ после выделения клеток, снижение отношения АТФ/АДФ и величины общего аденилатного пула суспензии рассматриваются как отражение неадекватных условий инкубирования гепатоцитов, ставящих под сомнение возможность их использования в этих условиях в качестве биологической модели для изучения специфических особенностей метаболизма печени. Так, например, инкубация гепатоцитов с бромбензеном, повреждающим плазматическую мембрану гепатоцитов, приводила к заметному падению в них концентрации АТФ во время инкубации. На гепатоцитах цыпленка показано, что отношение АТФ/АДФ зависит от способа получения клеток. Если их выделяли по методу Берри и Френда и получили суспензию с 92-96% неокрашенных гепатоцитов, отношение АТФ/АДФ было близко к 4 и практически не изменялось в течение часа инкубации. Если же клетки приготовляли бесперфузионным методом, используя технику срезов, то при таком же количестве неокрашенных клеток величина отношения АТФ/АДФ в свежевыделенных гепатоцитах была равна 2,8 и затем уменьшалась в течение последующего часа до 2,0. Это коррелировало со снижением внутриклеточной концентрации калия.
Использование значений различных параметров аденилатного пула в качестве критерия жизнеспособности клеток понятно, так как от состояния энергетической функции клетки зависит активность многих жизненно важных для гепатоцитов энергопотребляющих процессов, таких, как глюконеогенез, синтез мочевины, липогенез и др. Действительно, показаны прямые корреляции между изменением содержания адениннуклеотидов в гепатоцитах и глюконеогенезом, изменением содержания Na+ и К+ и величиной мембранного потенциала, а также транспортом Са2+.
Однако существуют разногласия по вопросу о связи параметров аденилатного пула с проницаемостью плазматической мембраны. По одним данным, они имеют высокую значимость положительной корреляции. Так, при повреждении клеток из-за продолжительного хранения на льду и последующего нагревания суспензии до 37°С величина АТФ/АДФ снижалась до 0,3 против 3,7 в свежеизолированных клетках и это совпадало с увеличением количества прокрашенных клеток от 5% в норме до 95% при повреждении. Резкое снижение концентрации АТФ в гипоксических условиях также сопровождалось необратимыми изменениями клеточной мембраны культивируемых гепатоцитов.
В то же время имеются данные об отсутствии четкой корреляции между концентрацией АТФ в клетках и степенью прокрашиваемости суспензии гепатоцитов. Это подтверждается и нашими исследованиями. Имеется лишь очень грубая корреляция между количеством прокрашенных трипановым синим гепатоцитов и изменениями концентрации АТФ.
Она сводится к тому, что при выделении гепатоцитов путем перфузии печени in situ (на наркотизированном животном) достаточно высокие значения АТФ можно получить лишь в том случае, если количество прокрашенных клеток в конечной суспензии окажется не более 20%. Несмотря на то что в последующие 60 минут количество прокрашенных клеток может даже несколько нарастать, концентрация АТФ в таких клетках не только не уменьшается во времени, но даже увеличивается и достигает через 30-60 минут значений, близких к перфузируемой печени. При наличии в свежевыделенной суспензии гепатоцитов более 20% прокрашенных клеток содержание АТФ в них резко падает до 0,4-0,2мкмоль/г влажного веса, хотя оно может еще несколько восстанавливаться в последующее. При увеличении числа клеток с поврежденными плазматическими мембранами до 50-70% эта способность теряется. При наличии же в суспензии 80% и более прокрашенных гепатоцитов они содержат мало АТФ и ее концентрация прогрессивно уменьшается до следовых количеств в течение 30-60 минут.
Из этих данных следует вывод, что содержание АТФ отражает не столько состояние плазматических мембран, сколько функциональное состояние самих гепатоцитов, определяемое в данной ситуации, по-видимому, процедурой выделения в целом. Дополнительным подтверждением этому служат данные о содержании АТФ в гепатоцитах, которые были выделены путем перфузии печени после декапитации животных без наркоза. Содержание АТФ в них было очень низким даже в том случае, когда все клетки были практически непрокрашены, т.е. имели интактные плазматические мембраны, и оно не увеличивалось во время инкубации.
Таким образом, изменения параметров аденилатного пула (в том числе содержания АТФ в клетке) являются, видимо, более чувствительным тестом, определяющим функционально-метаболический статус гепатоцитов в целом, нежели изменения проницаемости плазматической мембраны, оцениваемые по окраске трипановым синим. Эти изменения обнаруживаются до грубых нарушений плазматической мембраны и коррелируют с последним лишь в условиях сильных повреждений клеточного метаболизма, близких к патологии.
По-видимому, нельзя согласиться с мнением Баура и соавторов о том, что использование параметров аденилатного пула в качестве критериев жизнеспособности гепатоцитов менее информативно, нежели измерение содержания Na+ и К+, а также мембранного потенциала клетки, которые могут рассматриваться как парциальные регуляторы клеточного метаболизма, участвующие в поддержании гомеостаза клетки в условиях физиологической нормы. Даже небольшие изменения их значений, как правило, обратимы и не обязательно связаны с патологическими нарушениями. Их высокая реактивность в ответ на любое физиологическое и нефизиологическое воздействие делает затруднительным количественную оценку и стандартизацию наблюдаемого процесса. Истинный же регуляторный механизм должен иметь в своей основе способность сохранять в физиологических условиях постоянной концентрацию ведущих регуляторных параметров, что мы и видим на примере концентрации АТФ и отношения АТФ/АДФ, значения которых падают ниже физиологически необходимого уровня лишь в критических для клетки состояниях.
Параметры общего метаболизма в качестве критериев жизнеспособности гепатоцитов
В условиях in vivo клетка способна поддерживать внутренний гомеостаз и сохранять регуляции общего метаболизма. Это свойство лежит в основе жизнедеятельности организма, и степень сохранения гомеостаза после экстирпации клеточного или тканевого препарата определяет его функционально-метаболическую полноценность in vitro. Для печени in vivo специфичны следующие основные процессы:
- синтез альбумина,
- синтез мочевины,
- синтез глюкозы,
- синтез желчных кислот,
- метаболизм жирных кислот,
- биотрансформация ксенобиотиков.
Свежеизолированные гепатоциты сохраняют интенсивность метаболизма по большинству перечисленных показателей, близкую к перфузируемой печени.
С помощью подбора сред и условий инкубации, способствующих оптимизации специфических метаболических свойств паренхиматозных клеток, можно добиться того, что первые две функции будут осуществляться с достаточно высокой скоростью, приближающейся к перфузируемой печени или печени in vivo. Так, например, синтез мочевины обнаруживает тесную зависимость от содержания в среде доноров аммония и некоторых интермедиатов этого обмена (например, орнитина), а также предшественников глюконеогенеза и субстратов цикла Кребса, которые необходимы для синтеза аспартата. Он осуществляется лучше в неотмытых клетках и отсутствует в отмытых. Оба процесса находятся в прямой зависимости от интактности плазматической мембраны.
Характерным признаком метаболической полноценности гепатоцитов является низкая скорость утилизации глюкозы и ее превращения в лактат. Первым признаком потери метаболической специфичности гепатоцитов считается переход к гликолитическому типу обмена, связанному с окислением глюкозы и других углеводов.
Синтез глюкозы является одной из основных функций печени, которая сохраняется лишь в интактных гепатоцитах. В гепатоцитах с ненарушенной селективной проницаемостью мембраны и инкубируемых без субстратов наблюдается высокая скорость глюконеогенеза из лактата, пирувата, фруктозы, аминокислот. Скорость глюконеогенеза из лактата (10мМ) может достигать 37мкМ глюкозы/г в час. Она уменьшается при снижении жизнеспособности клеток и тесно коррелирует с концентрацией АТФ в них.
Большую роль в окислительно-восстановительном метаболизме гепатоцитов и его защите от многих внешних воздействий, в том числе химических соединений, играет глутатион. Его содержание в изолированных гепатоцитах варьирует в достаточно широких пределах. Уровень глутатиона в свежеизолированных гепатоцитах зависит от режима перфузии и состава инкубационной среды. Так, например, бескальциевый этап выделения гепатоцитов при перфузии печени может способствовать увеличению истечения глутатиона из клеток печени через синусоидальную мембрану. Это является одной из причин необходимости сокращения времени перфузии на этом этапе до 10 минут, когда описываемый эффект не успевает еще развиться. Улучшение техники выделения гепатоцитов сопровождалось повышением уровня глутатиона в клетках. Поэтому снижение концентрации восстановленной его формы, а также увеличение его истечения из клетки могут служить показателем интенсивности развития цитоксического эффекта при ее контакте с чужеродными агентами.
При длительном хранении содержание глутатиона также снижается. Однако и это может быть предотвращено подбором сред, содержащих предшественники глутатиона. Снижение содержания глутатиона во времени, как правило, коррелирует с интенсификацией ПОЛ и нарушением проницаемости плазматической мембраны гепатоцитов.
В поврежденных клетках чувствительность к гормонам отсутствует, так как высвобождающиеся неспецифические гидролазы разрушают гормональные рецепторы на поверхности плазматической мембраны. Именно поэтому гормональная рецепция в гепатоцитах была обнаружена сравнительно поздно, лишь с появлением совершенно интактных клеток. Стимуляция глюконеогенеза глюкагоном в гепатоцитах с истощенными запасами гликогена используется многими исследователями в качестве одного из важных критериев жизнеспособности гепатоцитов. Глюкагон активирует аденилатциклазу в плазматической мембране изолированных гепатоцитов. Наряду с этим в изолированных гепатоцитах установлена также гормональная рецепция для инсулина, катехоламинов, вазопрессина, ангиотензина, окситоцина, чувствительность различных параметров метаболизма к которым может использоваться в качестве критериев метаболической полноценности этих клеток.