Пользовательский поиск

Оценка состояния плазматической мембраны гепатоцитов

Многолетний опыт работы с гепатоцитами показывает, что со­стояние плазматической мембраны есть специфический феномен, чутко реагирующий на самые небольшие воздействия на клетку. В результате происходят нарушение ее селективной проницаемости, потеря растворимых энзимов и дезорганизация работы клетки в це­лом. Поэтому различные способы оценки состояния плазматический мембраны являются важными тестами на сохранение функциональ­ного статуса клетки.

Продолжение ниже

А.Г. Маленков о монографии Л.Д. Лукьяновой «Гепатоцит»

... естествознания. Вполне закономерно, что в конце XX столетия в этот список попадает гепатоцит — паренхиматозная клетка печени, один из главных и чрезвычайно ... ... свободнорадикальных процессов на клеточ­ных системах, роль плазматической мембраны и кальция в его ме­таболизме и жизнедеятельности. Именно собственный ...

Читать дальше...

всё на эту тему


Прокрашиваемость клеток трипановым синим — тест на их жизнеспособность

Метод визуального контроля за состоянием проницаемости плаз­матической мембраны клеток был предложен еще в 50-х годах и в первом приближении отражает ее изменения. Неповрежденные мембраны непроницаемы для трипанового синего при кратковременной инкубации; при этом даже неболь­шие включения красителя в цитозоле свидетельствуют о нарушений интактности клеточной мембраны. Метод очень прост и дает воз­можность без специального оборудования получить ответ в течение нескольких минут.

Наиболее часто употребляемая рабочая концентрация трипанового синего — 0,2%. Сеглен рекомендует 0,6%-ный раствор. Для этого 150мг красителя разводят в растворе NaCl (125мг в 25мл воды). Смесь пропускают через фильтр с от­верстиями = 0,22мкМ и доводят до общего объема 2мл. Этот основной раствор может длительное время храниться замороженным. Для окрашивания клеток 300мкл этого раствора добавляется к 100мкл суспензии (конечная концентрация трипанового синего равна, таким образом, 0,45%). Метод окрашивания гепатоцитов подробно описан Сегленом, а также другими авторами.

Для визуальной оценки повреждения клеток используется спо­собность ядерных белков адсорбировать краску. Даже самое слабое окрашивание ядра является индикатором повреждения клеточной мембраны. Неповрежденные паренхиматозные клетки имеют желтый цвет и хорошо очерченную выпуклую поверхностную линию, отражающую свет. Они легко отличимы по этому признаку от тем­ных поврежденных клеток даже без окрашивания в обычном све­товом микроскопе.

Процедура перенесения суспензии клеток в счетную камеру должна быть очень быстрой, чтобы предотвратить неспецифическую седиментацию клеток в пипетке. Покровное стекло притирается к камере до помещения туда суспензии. После этого на край стекла наносится капля суспензии и клетки с жидкостью засасываются в камеру капиллярными силами. Если же изменить порядок этой про­цедуры и притирать стекло на уже нанесенную каплю, может резко увеличиться количество поврежденных клеток.

Метод окрашивания трипановым синим имеет некоторые ограни­чения при своем использовании. Например, в присутствии замени­телей крови либо альбумина могут иметь место артефакты окраши­вания, так как краситель связывается в этом случае преимущественно с белками перфузата. Интенсивность окрашивания краси­телем может также различаться в зависимости от среды инкубации.

В клетках, окрашенных красителем, т.е. оцененных как повреж­денные, отмечаются нарушения и по другим метаболическим пара­метрам, которые также используются в настоящее время в каче­стве критериев интактности плазматической мембраны гепатоцитов: потеря растворимых энзимов цитозоля и выход К+ из клетки, уменьшение включения аминокислот в белки и гликолитической активности, снижение мембранного потенциала.

Тест на жизнеспособность клеток по их прокрашиваемости три­пановым синим выявляет необратимые изменения поверхности плазматической мембраны лишь при нейтральном pH, так как при повышении кислотности проницаемость клеток для красителя увеличивается.

В настоящее время считается возможным использовать в каче­стве модельной системы для экспериментальных целей суспензию гепатоцитов, в которой остаются непрокрашенными 80-95% кле­ток. В отдельных работах удается получить суспензии очень высо­кой чистоты, когда непрокрашенными остаются 95-98% клеток. Метаболические свойства суспензии гепатоцитов, в которых прокрашенные, т.е. поврежденные, клетки составляют все­го 5-20%, близки к срезам и перфузируемой печени.

В силу своей простоты и достаточно высокой воспроизводимости метод окрашивания клеток трипановым синим общепринят как обя­зательный экспресс-метод оценки качества суспензии гепатоцитов. Тем не менее тест на трипановый синий, по-видимому, недостаточно чувствителен для выявления незначительных повреждений плазматической мембраны, о которых свидетельствуют, например, перерас­пределение ионов в интро- и экстрацеллюлярном пространстве. Это связано с тем, что краситель сам проникает в клетки и окра­шивает их лишь тогда, когда плазматическая мембрана становится проницаемой для высокомолекулярных соединений, например бел­ков, и не может идентифицировать более ранние нарушения ее се­лективности, когда она становится доступной для низкомолекулярных соединений. На серьезные ограничения метода окрашива­ния трипановым синим, используемого для оценки жизнеспособно­сти изолированных гепатоцитов, и необходимость его дополнения другими методами обращали внимание многие исследователи.

Определение активности лактатдегидрогеназы

При повреждении плазматической мембраны из клеток проис­ходит выход растворимых энзимов. Поэтому способность гепатоцитов терять растворимые ферменты рассматривается как один из важных критериев оценки состояния их плазматической мембра­ны.

Лактатдегидрогеназа является одним из таких цитозольных фер­ментов, достаточно просто определяемых биохимическими способами. Наряду с трипановым синим определение увеличения концентрации лактатдегидрогеназы во внеклеточной среде стало одним из наиболее распространенных тестов оценки состояния плазматической мембраны . Бауру и сотрудникам уда­лось установить прямую зависимость активности лактатдегидрогеназы в суспензионной среде (супернатанте) от количества повреж­денных клеток. Однако чувствительность этого теста примерно такая же, как и для трипанового синего, и не имеет перед ним суще­ственных преимуществ. .

Наряду с лактатдегидрогеназным тестом определяют выход других ферментов из цитозоля.

Выход К+ из клеток — тест на состояние плазматической мембраны

Хорошо известно, что поддержание постоянной внутриклеточной концентрации ионов калия является общим свойством большинства животных и растительных клеток. Неудивительно поэтому, что воз­можность использования величины концентрации внутриклеточного калия в качестве параметра, характеризующего общее состояние изолированных клеток и их плазматических мембран, была исследо­вана сразу же, как только была осознана необходимость в поиске критериев жизнедеятельности гепатоцитов.

Содержание К+ и Na+ в неповрежденных свежеизолированных гепатоцитах (94% непрокрашенных трипановым синим клеток) со­ставляет 109±9,1 и 47,0±13,4мМ соответственно, что близко к зна­чениям, полученным в перфузируемой печени.

Абсолютная величина внутриклеточной концентрации калия мо­жет несколько варьировать в индивидуальных опытах от одного клеточного препарата к другому. Если исходная концен­трация К+ в клетке мала, то она, как правило, не достигает конт­рольного уровня в ходе дальнейшей инкубации. Такой пре­парат отличается малой жизнеспособностью гепатоцитов даже при низкой (менее 10%) их прокрашиваемости трипановым синим, и в процессе дальнейшей инкубации они резко ухудшают свои метабо­лические качества.

Содержание калия в клетке чутко реагирует на самые разные воздействия. Так, использование бескальциевой среды инкубации приводит к снижению внутриклеточного калия от 363 до 250нм/мг сухого веса. Показана зависимость содержания К+ в клетке от температуры инкубации. Непродолжительное хранение суспензии изолированных гепатоцитов на льду ведет к снижению содержания калия в клетке. Оно вновь нарастает при увеличении температуры инкубации до 37°С. В гепатоцитах мо­жет наблюдаться обратимое поглощение ионов К+, зависящее от межмембранного транспорта других ионов и причин, обусловливаю­щих его.

Сохранение достаточно высокой концентрации внутриклеточного калия — обязательное условие, необходимое как для нормального протекания важнейших метаболических процессов в клетке (глико­лиза, белкового синтеза и т.д.), так и для поддержания на физио­логическом уровне величины трансмембранной разности потенциа­лов. Таким образом, изменения внутриклеточного содержания калия могут сигнализировать как о мембранных, так и о плазматических нарушениях в клетке. Последние обязательно сопровождаются перераспределением ионного состава из-за неспособности клеток удерживать концентрационные различия в интра- и экстрацеллюлярном пространстве, и это в первую очередь касается калия и нат­рия. Аналогичные изменения ионного состава показаны для гепа­тоцитов.

Потеря К+ гепатоцитами и соответствующие изменения в отно­шении Na+/K+ начинаются до того, как наступают изменения в прокрашиваемости клеток трипановым синим или в содержании лактатдегидрогеназы. Так, снижение концентрации внутриклеточного калия в течение многочасовой инкубации клеток почти на 40% проходило на фоне практически неизмененного количества окрашенных клеток (6-8%). Гепатоциты, изолированные из печени цыпленка перфузионным и неперфузионным (из срезов) ме­тодами, имели существенно разное содержание внутриклеточного К+ (193 и 139нм/мг сухого веса соответственно), хотя они давали практически одинаковую реакцию на трипановый синий.

Таким образом, концентрация внутриклеточного калия является гораздо более чувствительным критерием, оценивающим поврежде­ние плазматической мембраны клеток и функциональное состояние гепатоцитов, нежели окрашивание трипановым синим. Однако опре­деление К+ в клетке — достаточно сложная процедура, требующая высокочувствительной измерительной аппаратуры либо селектив­ных электродов, что ограничивает использование этого метода.

Оценка состояния плазматической мембраны гепатоцитов с помощью мембранного потенциала

Мембранный потенциал свежеизолированных интактных гепато­цитов равен 36,4±3,4мВ, что сравнимо с перфузируемой пе­ченью (34мВ). Различные воздействия (изменение температуры, старение, высокие концентрации кальция в среде, лю­бое повреждение или просто изменение проницаемости мембраны) влияют на величину мембранного потенциала, уменьшая ее. Эти изменения могут наступать до видимых изменений в степени прокрашиваемости клеток трипановым синим, и проявля­ются одновременно с изменением калий-натриевого баланса. У кле­ток с поврежденными мембранами мембранный потенциал может падать практически до нуля. Поэтому наряду с изменением К+ и Na+ он рассматривается как наиболее чувствительный критерий состояния плазматической мембраны и жизнеспособности гепатоцитов. Однако измерения мембранного потенциала пока еще доста­точно сложны и малодоступны широкому кругу исследователей. Ве­личину мембранного потенциала определяют по соотношению вну­три- и внеклеточной концентрации одновалентных ионов (например, Сl-) или липофильных зондов типа тетрафенилфосфония.

Дыхание как критерий оценки состояния плазматических мембран изолированных гепатоцитов

Дыхательная активность изолированных гепатоцитов рассмат­ривается многими исследователями в качестве одного из основных критериев оценки их жизнеспособности.

Наиболее характерным признаком повреждения мембраны гепатоцитов является очень низкая ско­рость эндогенного дыхания, близкая у отмытых клеток к нулю. Ге­патоциты с неповрежденными мембранами обладают значительно более высокой скоростью эндогенного дыхания. Степень прокрашиваемости клеток трипановым синим связана обратной зависимостью со скоростью эндогенного дыхания суспензии. Аналогичные данные получены для гепатоци­тов, инкубируемых в растворе, содержащем глюкозу.

Таким образом, различия в значениях суммарных скоростей ды­хания суспензии гепатоцитов отражают вклад клеток с поврежден­ными мембранами и могут быть использованы в качестве критерия оценки относительного количества клеток в суспензии с интактными плазматическими мембранами и, видимо, интактной внутриклеточ­ной структурой.

Существуют дополнительные специфические «дыхательные» те­сты на проницаемость плазматических мембран гепатоцитов. Они основаны на неспособности ряда субстратов (интермедиатов ЦТК, в том числе сукдината, а также НАДН и НАДФН) проникать через неповрежденные мембраны клеток.

В интактных клетках сукцинат проникает через плазматическую мембрану с очень низкой скоростью. Считается, что только 5% по­требляемого клеткой кислорода связано с утилизацией экзогенного сукцината, который участвует в метаболизме глюкозы. Изве­стно также, что сукцинат не стимулирует дыхание перфузируемой печени и не накапливается в ее клетках. По этой причине он считается маркером интактности плазматической мембраны.

Однако в поврежденных гепатоцитах с нарушенной селективной проницаемостью плазматической мембраны сукцинат диффундирует в клетку и окисляется в ЦТК, сильно стимулируя дыхание. Это связано с тем, что сукцинатоксидазный путь окисления в дыхательной цепи митохондрий сохраняется в таких клетках высокоактивным, несмотря на морфологические изменения внешней мембраны митохондрий. Последняя является, видимо, причиной подавления функции НАД-зависимого пути окисления и неэффективности влияния на дыхание НАД-зависимых субстра­тов — интермедиатов ЦТК.

Чем больше в суспензии клеток с поврежденными мембранами, тем больше видимый эффект сукцината, стимулирующий эндоген­ное дыхание. В присутствии сукцината коэффициент ды­хательного контроля суспензии гепатоцитов с большим количеством поврежденных клеток значительно выше, чем в срезах печени, где он не превышает 2,5-3,1.

Учитывая, что сукцинат практически не проникает через интактную плазматическую мембрану, при наличии в суспензии не менее 50% жизнеспособных клеток, окисляющих эндогенные субстраты, коэффициент дыхательного контроля сукцината не должен быть бо­лее 1,2-1,4 при его концентрации 1мМ. Сходные результаты имеются для клеток, предварительно преинкубированных в присутствии глю­козы.

Оценка изменения проницаемости плазматических мембран с помощью «сукцинатного теста», по-видимому, гораздо более инфор­мативна, нежели по прокрашиванию трипановым синим. Это демон­стрируется на примере гепатотоксического вещества хлорпромазина. Хлорпромазин в очень низкой концентрации (5мкмоль) нару­шает проницаемость плазматических мембран лишь к низкомоле­кулярным веществам. Это сразу же обнаруживается по появлению стимулирующего дыхание действия сукцината (1мМ). Трипановый синий не выявляет при этом никаких изменений в состоянии мембраны, так как никаких существенных различий в прокрашиваемости клеток не происходит. Она увеличивается лишь при концентра­ции хлорпромазина 50-100мкмоль, когда плазматическая мем­брана становится проницаемой для белковых соединений. Выход лактатдегидрогеназы из гепатоцитов под влиянием хлорпромазина регистрируется при его концентрации 50мкмоль, а глутаматоксалоцетаттрансаминазы — при концентрации 100мкмоль.

В качестве дополнительного теста на состояние плазматической мембраны суспензии гепатоцитов может быть использован анализ действия на дыхание двух последовательных добавок сукцината в нарастающих концентрациях (1 и 10мМ). Эффекты этих двух концентраций различаются очень существенно при наличии в суспензии высокого количества окрашенных гепатоцитов. Они практически нивелируются, когда число прокрашенных клеток в суспензии не превышает 20%, что обусловлено низкой проницаемостью интактных плазматических мембран к этому субстрату, даже если он присутствует в среде в перенасыщающих концентрациях.

Плазматическая мембрана клеток непроницаема ни для НАДН, ни для НАДФН. Поэтому оба кофермента также можно использовать в качестве показателей состояния плазматических мембран изолированных гепатоцитов. Однако дыхательный тест на НАДН применим только при добавлении последнего на фоне эндогенного дыхания. Эффект очень слабо выражен, если гепатоциты преинкубировали в растворе, содержащем глюкозу. Ориентация метаболического потока в последнем случае, видимо, такова, что экзогенный НАДН сравнительно плохо используется клетками даже с поврежденными плазматическими мембранами.




© Авторы и рецензенты: редакционный коллектив оздоровительного портала "На здоровье!". Все права защищены.


 
Текст сообщения*
Защита от автоматических сообщений
Загрузить изображение
 

nazdor.ru
На здоровье!

Пользовательский поиск

Узнайте больше:

А.Г. Маленков о монографии Л.Д. Лукьяновой «Гепатоцит»


Роль трансмембранного переноса восстановительных эквивалентов в регуляции энергетического обмена изолированных гепатоцитов


Роль восстановленного глутатиона при индукции ПОЛ в гепатоцитах


Дыхание как показатель функционального состояния изолированных гепатоцитов


Взаимосвязь ПОЛ и токсического действия химических соединений в гепатоцитах


Эндоцитоз гликопротеидов в гепатоцитах


Перекисное окисление липидов в гепатоцитах


Функция плазматической мембраны гепатоцитов


Взаимоотношения систем генерации и утилизации гидроперекисей в гепатоцитах


Дыхание изолированных гепатоцитов, сопряженное с активностью митохондриальной дыхательной цепи


Всё на тему мембраны, гепатоцит



Большинство диет для похудения просто крадут ваши деньги

Логин:

Пароль:



Забыли свой пароль?
Регистрация
войти / регистрация

Беременность | Лечение | Энциклопедия | Статьи | Врачи и клиники | Сообщество


О проектеКарта сайта β На здоровье! © 2008—2015
nazdor.ru, nazdor.com
Контакты Наш устав

Рекомендации и мнения, опубликованные на сайте, являются справочными или популярными и предоставляются широкому кругу читателей для обсуждения. Указанная информация не заменяет квалифицированную медицинскую помощь, основанную на истории болезни и результатах диагностики. Обязательно проконсультируйтесь с врачом.

Размещенные на сайте информационные материалы, включая статьи, могут содержать информацию, предназначенную для пользователей старше 18 лет согласно Федеральному закону №436-ФЗ от 29.12.2010 года "О защите детей от информации, причиняющей вред их здоровью и развитию".