Изменение параметров кальцийтранспортирующих систем должно, очевидно, сопровождаться по крайней мере краткосрочным изменением концентрации ионов кальция в цитоплазме. Необходимость изучения особенностей регуляции транспорта кальция в эндоплазматическом ретикулуме и митохондриях печени обусловлена также данными о перераспределении кальция между этими структурами в процессе гормональной активации гепатоцитов.
Данные по аккумуляции кальция эндоплазматическим ретикулумом печени немногочисленны. Было обнаружено, что поглощение кальция эндоплазматическим ретикулумом на порядок увеличивается при добавлении АТФ, достигая значений 30 нмоль/мг белка за 30 минут (К0,5 для кальция = 5мкМ); при добавлении неорганического фосфата или оксалата кальцийаккумулирующая способность увеличивалась соответственно в 2 и 10 раз.
Следует отметить, что подобный эффект оксалата был ранее описан для саркоплазматического ретикулума скелетной, сердечной и гладкой мускулатуры. Однако в отличие от этих систем сродство Са-насоса эндоплазматического ретикулума печени к Mg – АТФ примерно на порядок меньше (К0,5 = 500мкМ). Судя по отсутствию влияния рутениевого красного на транспорт кальция в эндоплазматическом ретикулуме печени, полученная мембранная фракция не содержит существенной примеси митохондрий. Однако по непонятным причинам скорость аккумуляции 45Са этой фракцией уменьшается на 70-80% после добавления калиевого или протонного ионофора. Для эндоплазматического ретикулума печени отсутствуют также данные о природе фосфорилированного интермедиата, субстратной специфичности, возможности регуляции цАМФ- и кальмодулинзависимыми протеинкиназами.
Было обнаружено, что при внутрибрюшинном введении глюкагона или инсулина или при предварительной перфузии печени этими соединениями максимальная скорость аккумуляции кальция эндоплазматическим ретикулумом увеличивается соответственно на 40% и уменьшается на 20%. При определении активности Са-АТФазы ретикулума влияния глюкагона и инсулина как на максимальную активность, так и на сродство к ионам кальция не обнаружено. В связи с этим было сделано предположение, что указанные выше гормоны изменяют эффективность сопряжения гидролиза АТФ Са-АТФазой с функционированием Са-насоса. Следует, однако, отметить, что при определении АТФазной активности в этой работе был использован комплексон ЭГТА (1мМ), что привело к 5-кратному увеличению сродства системы к ионам кальция. Можно предположить, что ЭГТА, модифицируя кальциевый насос ретикулума, устраняет его чувствительность к действию глюкагона и инсулина.
Как и в случае других тканей, кальцийаккумулирующая способность митохондрий печени обусловлена переносчиком, локализованным на внутренней мембране органелл и осуществляющим противоградиентный транспорт ионов кальция из цитоплазмы в матрикс по механизму электрофореза. Энергетической основой для работы этого переносчика служит электрический потенциал, достигающий в интактных митохондриях значения —180мВ. Уменьшение абсолютной величины потенциала до нуля с помощью разобщителей окислительного фосфорилирования или совместного введения ингибиторов переноса электронов (CN-, антимицин, ротенон и др.) и АТФазной реакции (олигомицина) полностью приостанавливает захват 45Са органеллами.
Вход кальция в митохондрии ингибируется также рутениевым красным без существенного влияния на электрический потенциал митохондрий. По крайней мере в случае гепатоцитов рутениевый красный можно считать наиболее селективным ингибитором, так как на Са-АТФазу плазматических мембран он влияет при концентрации около 10-8М. Влияние рутениевого красного на аккумуляцию кальция эндоплазматическим ретикулумом печени не обнаружено. Сродство переносчика к ионам кальция в митохондриях варьирует в широких пределах, что, очевидно, связано с условиями экспериментов (присутствие ионов магния, АТФ, ортофосфата, кальциевого хелатора). Так, например, при введении в среду инкубации 0,1мМ ЭГТА сродство кальцийтранспортирующей системы митохондрий печени к ионам кальция увеличивается на порядок.
В соответствии с уравнением Нернста (и при условии, что существует только описанная выше система транспорта кальция) при потенциале на внутренней мембране органелл — 180мВ и при концентрации ионов кальция в цитоплазме от 0,1 до 1,0мкМ концентрация ионов кальция в матриксе митохондрий должна составлять 0,1-1М, что по крайней мере на два порядка выше, чем наблюдается в эксперименте. В связи с этим следует предположить наличие в митохондриях систем, обеспечивающих выход кальция из органелл.
В настоящее время в качестве таких систем рассматриваются системы натрий- и протонзависимого выхода ионов кальция. Обе эти системы не зависят от рутениевого красного, что дает основание говорить о том, что механизм входа и выхода кальция из митохондрий принципиально различны. Существование натрийзависимого механизма выхода кальция показано для митохондрий миокарда, головного мозга, скелетной мускулатуры, надпочечников. В митохондриях печени скорость этого процесса примерно на два порядка меньше и несколько увеличивается только после понижения концентрации ионов кальция с помощью ЭГТА.
В этой связи роль основного механизма выхода кальция из митохондрий печени отводится электронейтральному кальцийпротонному (Са2+/2Н+) обмену. Показано, что эффективность этого процесса увеличивается по мере увеличения окисленности пиридиновых нуклеотидов (уменьшение соотношения НАДФН/НАДФ). В качестве окисляющего агента в этих экспериментах использовали ацетоацетат. Предполагается, что влияние уровня окисленности пиридиновых нуклеотидов на транспорт кальция в митохондриях опосредовано через состояние тиоловых групп в мембране.
Каковы возможные пути вовлечения кальцийтранспортирующей системы митохондрий в регуляцию гормональной чувствительности клеток? В 1974г. в лаборатории Борля было показано, что добавление цАМФ к митохондриям различных тканей вызывает увеличение скорости выхода 45Са. Однако впоследствии эти наблюдения подтверждены не были. Установлено небольшое увеличение скорости выхода 45Са из митохондрий печени при действии цАМФ, но эти наблюдения получены в среде, где в качестве субстрата окислительного фосфорилирования использовали не сукцинат, а пальмитоил-коэнзим А и эффект цАМФ связан, по-видимому, с влиянием на соотношение окисленных и восстановленных форм пиридиновых нуклеотидов. Возможность изменения соотношения НАДН/НАД в митохондриях печени в ответ на активацию аденилатциклазы показана на примере глюкагона. После предварительной инкубации гепатоцитов с этим гормоном показано увеличение соотношения гидроксибутират/ацетоацетат в гомогенате клеток.
В последнее время появилось сообщение о том, что при предынкубации гепатоцитов с бета-агонистами, глюкагоном или дибутирил-цАМФ существенно увеличивается скорость натрийзависимого выхода 45Са из митохондрий. В этой связи можно предположить, что отсутствие значительного влияния цАМФ на скорость выхода 45Са из митохондрий в опытах на бесклеточных системах связано с потерей в процессе выделения органелл некоего лабильного фактора.
Выход ионов кальция из митохондрий может быть также индуцирован добавлением жирных кислот (особенно полиненасыщенных), и в использованных концентрациях их действие непосредственно не связано с разобщением дыхания и окислительного фосфорилирования. Этот эффект, очевидно, следует учитывать, если активация фосфолипазы А является одним из звеньев механизма проведения гормонального возбуждения. Еще больший эффект на кальцийаккумулирующую способность внутриклеточных структур оказывают простагландины, которые рассматриваются некоторыми авторами как кальциевые ионофоры.
Следует также отметить, что, проникая в митохондрии, кальций при достаточной его концентрации способен образовывать преципитирующие комплексы с АТФ и неорганическим фосфатом, понижая тем самым концентрацию свободного кальция в матриксе. Поэтому внутриклеточная концентрация АТФ и ортофосфата, определяемая эффективностью работы ортофосфатногидроксильного переносчика и адениннуклеотидтранслоказы, может существенно модифицировать соотношение скоростей входа и выхода кальция в органеллах.
При действии альфа-агонистов на гепатоциты происходит изменение содержания ионов кальция в митохондриях. При исследовании скоростей входа и выхода 45Са в митохондриях после перфузии печени с альфа-агонистами были получены следующие результаты. Уже через 1 минуту перфузии печени с фенилэфрином наблюдаются увеличение скорости поглощения 45Са митохондриями, примерно двукратное увеличение времени полуудержания “Са в присутствии ортофосфата и 30%-ное уменьшение содержания общего кальция в митохондриях; через 6 минут эти эффекты исчезали. Подобное действие оказывала перфузия с адреналином, причем эффект адреналина снимал альфа-, но не бета-антагонист. Подобные эффекты давал и глюкагон, но при этом время перфузии было в 2-3 раза больше, чем в случае альфа-агонистов. Показано также, что после воздействия альфа-агонистов в митохондриях печени наблюдается уменьшение скорости выхода 45Са, индуцированного введением ЭГТА.
Получены данные о 50%-ном уменьшении содержания АДФ и общих адениновых нуклеотидов, а также о снижении скорости окисления НАДФН, индуцированного ацетоацетатом, в митохондриях печени после воздействия фенилэфрина. В этой связи можно предположить, что в основе изменения скоростей входа и выхода кальция в митохондриях печени после воздействия альфа-агонистов лежат изменения скоростей переноса нуклеотидов адениннуклеотидтранслоказой и уровня окисленности пиридиновых нуклеотидов.
Более детальный анализ состояния систем, контролирующих скорость выхода кальция из митохондрий печени после воздействия альфа-агонистов, был проведен Коллом с соавторами. В этой работе исследовали зависимость скорости выхода ионов кальция от его концентрации в матриксе. После воздействия фенилэфрина сродство этой кальцийтранспортирующей системы увеличивалось в 2 раза без изменения максимальной скорости. Влияние глюкагона обнаружено не было. Не обнаружено также влияния глюкагона на стационарный уровень свободного кальция, который могут поддерживать митохондрии печени in vitro.
Известно, что адреналэктомия приводит к понижению гормональной чувствительности жировой ткани к действию как адреналина, так и других гормонов, активирующих аденилатциклазу; эффект адреналэктомии устраняется после дальнейшей терапии глюкокортикоидами. В случае гепатоцитов ситуация сложнее: адреналэктомия приводит к уменьшению чувствительности к глюкогону, увеличению чувствительности к действию адреналина, опосредованного через бета-рецепторы и к уменьшению чувствительности к альфа-рецепторному пути. Чувствительность к вазопрессину и А23187 не изменяется. Так как соотношение альфа- и бета-рецепторов после адреналэктомии не изменяется, можно предположить, что внутриклеточный кальций выполняет роль связующего звена в системе взаимоотношения регуляции углеводного метаболизма печени глюкокортикоидами и катехоламинами. В самом деле, еще в середине 60-х годов обнаружено, что при воздействии стероидных гормонов изменяется кальцийаккумулирующая способность митохондрий. Так, например, при введении животным дексаметазона скорость поглощения кальция митохондриями печени в присутствии АТФ и ортофосфата уменьшалась в 2 раза, а время полуудержания 45Са в присутствии ортофосфата, но в отсутствие АТФ увеличивалось в 3-4 раза.
Остается, однако, открытым вопрос о механизме передачи сигнала с рецепторов стероидных гормонов на кальцийтранспортирующие системы митохондрий печени. Известно, что эффекты глюкокортикоидных гормонов и инсулина на аккумуляцию кальция митохондриями устраняются при одновременном введении циклогексимида. Вероятно, в этих случаях процесс передачи сигнала опосредован через регуляцию белкового синтеза на стадии трансляции.
К настоящему времени твердо установлено, что в гепатоцитах внутриклеточный кальций выполняет роль посредника в проведении гормонального возбуждения от альфа-рецепторов и рецепторов некоторых пептидов (антиотензина II, вазопрессина) на фермент-исполнитель. Накоплено достаточно данных и о возможности регуляции ионами кальция чувствительности гепатоцитов к действию бета-агонистов и других активаторов аденилатциклазы.
Однако в большинстве случаев конкретные механизмы сопряжения активации клеток печени и изменения внутриклеточного распределения кальция остаются неизвестными. Во многом это обусловлено тем положением, что в отличие от клеток возбудимых тканей механизмы функционирования кальцийтранспортирующих систем печени мало изучены. Так, например, остается открытым вопрос о системе, контролирующей скорость поступления кальция в клетку и о возможности ее гормональной регуляции.
Несмотря на обширную литературу о взаимоотношении активации альфа-рецепторов и фосфоинозитидного эффекта, до сих пор отсутствуют однозначные данные о наличии в плазматической мембране гепатоцитов гормонзависимых Са-каналов. В самом деле, эксперименты на изолированных клетках, где в ответ на активацию альфа-рецепторов зарегистрировано изменение скоростей входа или выхода Са, можно интерпретировать как в терминах изменения проницаемости плазматической мембраны, так и в терминах перераспределения кальция между внутриклеточными пулами. В той же мере изменение содержания кальция в митохондриях и эндоплазматическом ретикулуме после гормонального возбуждения может быть следствием изменения концентрации ионов кальция в цитоплазме. Если же высвобождение кальция из внутриклеточных пулов является непосредственной причиной увеличения его концентрации в цитоплазме, то совершенно не ясна природа посредника, передающего сигнал от рецептора на митохондрии или ретикулум. В ряде случаев (например, при перфузии печени с глюкогоном) увеличение максимальной скорости Са-насоса эндоплазматического ретикулума не прослеживается, если в перфузат введен циклогексимид. Можно предположить, что в этом случае сигнал передается регуляторной субъединицей протеинкиназы. Однако инерционность этого процесса делает его малоприемлемым для объяснения проведения возбуждения от альфа-рецепторов в общем случае.
Не ясно также в принципе, в какой мере модификация кальцийтранспортирующих систем внутриклеточных мембран гепатоцитов может отразиться на концентрации ионов кальция в цитоплазме. Так, например, добавление блокатора транспорта кальция в митохондрии — рутениевого красного — абсолютно не влияет ни на кинетику поглощения 45Са гепатоцитами, ни на концентрацию ионов кальция в цитоплазме. В отличие от клеток нервной ткани кинетика поглощения 45Са гепатоцитами также мало зависит от присутствия олигомицина и антимицина А.
Очевидно, для решения всех этих вопросов, кроме детального изучения особенностей функционирования кальцийтранспортирующих систем мембран гепатоцитов, необходим поиск новых методических подходов. Один из таких подходов был недавно разработан в лаборатории Тсайна, где синтезировано соединение, позволяющее следить за концентрацией свободного кальция в цитоплазме. В отличие от описанного выше метода регистрации нулевой точки, данный метод обладает хорошим временным разрешением и позволяет проводить эксперименты при физиологической концентрации ионов кальция в среде инкубации. Этим методом показано, что уже в первые 1-2 секунды после воздействия альфа-агонистов и через 3-4 секунды после воздействия вазопрессина или ангиотензина II концентрация ионов кальция в цитоплазме гепатоцитов увеличивается в 3 раза. Этот эффект не устранялся, если за несколько секунд до введения агентов резко понизить концентрацию ионов кальция в среде инкубации с помощью ЭГТА. Эти данные позволяют считать наиболее актуальными для решения рассматриваемой проблемы работы, направленные на выяснение природы посредника, передающего сигнал от альфа-рецепторов или рецепторов пептидных гормонов к системам, вызывающим высвобождение кальция из внутриклеточных пулов.
