Пользовательский поиск

Транспорт ксенобиотиков в гепатоцитах

Исследования транспорта ксенобиотиков в печени, почках, лим­фоцитах и других клетках показали, что по крайней мере для не­которых из них существуют специальные системы переноса. Если эволюционный смысл существования особых транспортных систем для сахаров, аминокислот, жирных кислот и даже витаминов ясен, то целесообразность присутствия таких систем в клетках для ве­ществ, поступление которых в организм не запрограммировано при­родой, во многом непонятно. Согласно одной из гипотез, перенос многих ксенобиотиков в клетку осуществляется теми же переносчи­ками, которые ответственны за транспорт аминокислот и сахаров.

Продолжение ниже

Гепатоциты как модель для изучения биотрансформации веществ

... аргументы в пользу того, что функ­циональные аспекты биотрансформации ксенобиотиков могут и должны изучаться в условиях сохранения интегрированности ... ... активным транспортом. Преимущества использования свежеизолированных гепатоцитов млекопитающих для изучения процессов биотрансформации ...

Читать дальше...

всё на эту тему


Есть также предположение о существовании специфичных си­стем транспорта органических анионов, катионов и нейтральных мо­лекул. Вероятно, что обе гипотезы отражают различные свойства одних и тех же транспортных систем, знание механизмов которых необходимо для решения обширного круга актуальных задач ток­сикологии, фармакокинетики и родственных направлений.

При изучении транспорта ксенобиотиков существуют общие про­блемы. Интенсивность этого процесса оценивается по изменению внутриклеточной концентрации веществ. Стационарная концентра­ция вещества в клетке печени определяется соотношением скоро­стей следующих процессов:

  1. его транспорта через плазматическую мембрану из внеклеточной среды в клетку и в обратном направле­нии;

  2. метаболических превращений вещества в клетке;

  3. связы­вания вещества с внутриклеточными и мембранными компонента­ми;

  4. экскреции вещества из клетки.

Именно этим многообразием обусловлены трудности, возникающие при проведении эксперимен­тальных работ в этой области.

Использование изолированных гепатоцитов для решения этих вопросов имеет свои преимущества и недостатки. С одной стороны, только на изолированных клетках можно провести измерение на­чальных скоростей переноса, знание которых нужно для получения кинетических характеристик. С другой стороны, при изоляции мо­жет произойти нарушение работы механизмов, ответственных, на­пример, за выделение желчи, вызванное, в частности, морфологи­ческими изменениями в экскреторных участках клеточной мембра­ны. Это, в свою очередь, может изменить баланс между входящим и выходящим потоками вещества.

Биотрансформация ксенобиотиков происходит в основном в гепатоцитах. Метаболиты, образующиеся при этом, и в первую оче­редь конъюгаты, могут ингибировать транспорт исходного вещества из клетки через базальную мембрану. Есть основания полагать, что скорость биотрансформации может лимитировать весь процесс. По этой же причине конъюгация затрудняет исследование механизмов экскреции. Способность многих ксенобиотиков связываться с белка­ми клеточной мембраны или внутриклеточными компонентами ме­шает точному определению концентрации вещества в клетке и вне­клеточном пространстве. Ее корректная количественная оценка практически осуществима только на изолированных клетках.

Для целого ряда ксенобиотиков показано существование актив­ного переноса. Однако энергетика транспорта мало изучена. Как правило, большинство авторов ограничивается исследованием дей­ствия разобщителей и ингибиторов окислительного фосфорилирования на скорость переноса или накопления вещества в клетке или оценкой величины Na-зависимой компоненты транспорта.

Большое число экзогенных соединений попадает в печень в за­ряженной форме. Распределение этих веществ между клеткой и внешней средой зависит от величины мембранного потенциала. Однако только в единичных работах предпринята попытка устано­вить связь между электрическим потенциалом на клеточной мем­бране и работой транспортных систем, осуществляющих перенос ксенобиотиков в клетки.

Наконец, знание особенностей трансцеллюлярного переноса ока­зывается крайне полезным при токсикологических исследованиях. Взаимодействие между различными соединениями на уровне кле­точного поглощения может модифицировать токсическое или протектирующее действие некоторых препаратов. Примером может служить защитное влияние преинкубации гепатоцитов с трипсином против повреждающего действия фаллоидина. Сама по себе эта процедура приводит к повреждению клеточной мембраны за счет протеолитической активности этого фермента. Но взаимодействие трипсина с мембраной вызывает частичную инактивацию рецепто­ра фаллоидина на внешней ее стороне, вследствие чего уменьшается поступление этого токсина в клетку.

Такая же картина наблюдалась при искусственно вызванном пе­ченочном холестазе. Если перевязать желчный проток у крысы, то скорость поглощения фаллотоксинов значительно (на 75-85%) снижается в течение первых 2-4 часов и затем мало меняется в течение нескольких суток после перевязки. Это снижение наблюдалось в пе­чени in vivo, в перфузируемой печени после наступления холестаза и в изолированных гепатоцитах, полученных у холестатических крыс.

Так как скорость поглощения токсинов уменьшается уже в ран­ние сроки, когда морфологические изменения клеточной мембраны под действием холестаза не успевают проявиться полностью, авторы заключили, что модификация транспорта этих веществ в клетку вызывался изменением концентрации солей желчных кислот, воз­никающих при холестазе.

Токсичность некоторых веществ может заключаться в их воз­действии на транспортные системы клетки. Так, например, желчные кислоты ингибируют транспорт метотрексата; его поступление в клетки во время химиотерапии регулируется содержанием солей желчных кислот в печеночных синусоидах.

Проникновение большинства известных ксенобиотиков обуслов­лено, вероятно, простой диффузией. Однако для многих из них по­казано наличие транспортных систем, ответственных за перенос ве­ществ через плазматическую мембрану. Ясно, что нельзя предпо­лагать существование отдельных специализированных систем пере­носа для каждого соединения. По общему мнению исследователей, транспорт молекул чужеродных веществ осуществляется несколь­кими системами, специфичными к знаку заряда на этих молекулах. Поэтому для модельных экспериментов используется ограниченное количество маркерных субстратов, таких, как: бромсульфофталеин и его не метаболизирующийся в печени аналог — дибромсульфофталеин; индоциановый зеленый; флуоресцин; желчные кислоты; оуабаин и т.д.

При изучении системы, ответственной за транспорт органических анионов в гепатоцитах, чаще всего используются бромсульфофталеин и его аналоги. Существуют противоречивые данные о харак­тере транспорта бромсульфофталеина через плазматическую мем­брану. В большинстве работ приведены доказательства того, что проникновение этого ксенобиотика в клетку происходит по типу облегченной диффузии (пассивный транспорт). В то же время известна чувствительность транспорта этого вещества к метаболическим ингибиторам, что указывает на энергозависимость процесса поглощения. Возможно, что одной из причин появления проти­воречивых данных служит маскирующее влияние образующихся конъюгатов и связывание самого вещества с внеклеточными бел­ками. Для дибромсульфофталеина было показано, что скорость его поглощения зависит от внеклеточной концентрации белка и описы­вается кинетикой Михазлеса – Ментон. Транспортная система для дибромсульфофталеина имеет энергозависимую и неэнергозависи­мую компоненты и не зависит от концентраций ионов натрия. Оба аналога имеют по два места связывания на плазматической мембране с различным сродством: 4,8 и 70мкМ для бром­сульфофталеина и 1,3 и 48мкМ для дибромсульфофталеина. Выход из клетки последнего лишь незначительно зависит от энер­гетических затрат, но не от концентрации ионов Na+. Выделение дибромсульфофталеина с желчью лимитирует также транспорт это­го соединения из клетки; в изолированных гепатоцитах способность к его секреции частично снижена. Поглощение дибромсульфофта­леина может идти и против электрохимического градиента.

Транспорт бромсульфофталеина, так же как и некоторых других органических анионов, из клетки в желчь является активным про­цессом, который тоже идет против электрохимического градиента. Конъюгация бромсульфофталеина с внутриклеточным глютатионом не влияет, по-видимому, на скорость поступления в клет­ку, но уменьшает скорость его выхода из клетки.

Наиболее часто используется в модельных экспериментах элек­трически нейтральное соединение — оуабаин. Это вещество не метаболизируется и не связывается с внутриклеточными белками. Поглощение оуабаина в изолированных гепатоцитах — энергозависимый процесс, чувствительный к ингибитору SH-групп. Циа­нид снижает скорость поступления ксенобиотиков в клетку на 40%, ротенон — на 60%, 2,4-динитрофенол — на 90%. Небольшое ингиби­рование (15%) отмечалось при понижении температуры от 37 до 27°С. Перенос оуабаина через клеточную мембрану внутрь клетки не зависит от внеклеточной концентрации катионов и pH и может идти против градиента концентрации. Отношение концентраций клетка – среда для оуабаина достигает 170. Замена натрия на холин не влияет на скорость поглощения оуабаина. Органиче­ские анионы (бромсульфофталеин, индоциановый зеленый и др.) не оказывают ингибирующего действия на транспорт оуабаина, тогда как сердечные гликозиды и некоторые гормоны уменьшают скорость его всасывания гепатоцитами.

Выход оуабаина из гепатоцитов не связан с его поглощением, нуждается в метаболической энергии, но не зависит от концентра­ции SH-групп в клетках. Есть основания полагать, что транспорт оуабаина опосредован переносчиком стероидов в клетке.

Способность гепатоцитов к поглощению желчных кислот явля­ется важным показателем их функциональной активности. По дан­ным кинетического анализа транспорт желчных кислот осущест­вляется двумя системами одновременно — активной (насыщаемой) и пассивной, работающей по типу простой диффузии (ненасыщае­мой). Активная компонента транспорта таурохолата— наи­более часто используемого маркерного субстрата систем переноса желчных кислот — чувствительна к натрию .

Концентрация желчных кислот в крови здорового организма — 60мкМ, диффузионная компонента в норме играет незначительную роль. Однако при некоторых патологиях концентрация таурохолата может увеличиться до 100мкМ и соответственно возрастает зна­чение простой диффузии. Скорость (но не Км) транспорта таурохолата уменьшается в присутствии аминокислот, переносимых Na-зависимым путем, и не меняется при внесении субстратов Na- независимых систем. Скорость активного транспорта желчных кис­лот зависит от их химического строения (числа гидроксильных групп) и для дигидрооксихолиевых кислот выше, чем для тригидрооксихолиевых, имеющих более высокое сродство. В изолированных клетках скорость выведения таурохолата может служить характе­ристикой секреции желчных кислот. Было показано, что экскреция таурохолата — энергозависимый, насыщаемый процесс, очень чув­ствительный к антимицину А.

Кинетический анализ и изучение действия ингибиторов показы­вают, что секреция желчных кислот в изолированных клетках пе­чени хорошо сохраняется.

Очень интересные и важные результаты были получены Блю­мом с соавторами. Ими было проведено сравнительное изуче­ние скорости поглощения трех маркерных органических субстра­тов — аниона (дибромсульфофталеина), катиона (d-тубокурарина) и нейтрального соединения (оуабаина) — одновременно на трех мо­делях: целом организме, перфузируемой печени и изолированных клетках. Экспериментально полученные значения скорости погло­щения этих веществ клеткой и экскреции из нее были скорректи­рованы с учетом скорости кровотока (перфузата в печени) и коли­чества субстрата, связанного с внеклеточными белками. Скорость исчезновения из внешней среды для дибромсульфофталеина и оуабаина при инкубации с изолированными клетками в 2-3 раза меньше, чем в интактном органе. В изолированных гепатоцитах снижена (по сравнению с in vivo) скорость секреции d-тубокурарина и оуабаина. Скорость секреции из клеток дибромсульфофталеи­на и поглощение клетками d-тубокурарина практически не изменя­лись. Таким образом, имеющиеся в литературе данные подтверждают наличие хорошего качественного совпадения характеристик транспортных систем изолированных клеток печени и целой пе­чени.

Ключом к пониманию природы наблюдаемых для этих моделей количественных различий в скоростях поглощения могут служить результаты, полученные при изучении транспорта метотрексата. Предполагается, что перенос метотрексата осуществляется той же системой, что и перенос таурохолата. Она имеет две компоненты: одну с высоким сродством к субстрату, вторую — с низким, частич­но насыщаемую. Обе компоненты чувствительны к метаболическим ингибиторам и зависят от температуры, что указывает на активный характер переноса этого ксенобиотика. Скорость поглощения метотрексата клетками в монослойной культуре меньше, чем целой печенью. С увеличением срока культивирования (от 24 до 48 часов) наблюдается дальнейшее снижение скорости поглощения.

Снижение скорости транспорта метотрексата невозможно объ­яснить ухудшением мембранной проницаемости. Более естествен­ной выглядит гипотеза авторов о том, что наблюдаемый эффект вы­зван изменением гормонального баланса в клеточном окружении.

Действительно, добавка каждого из гормонов — D-гексаметазона, глюкагона, а также альфа-токоферола в среду инкубации стабили­зирует мембраны и значительно (в среднем на 250%) увеличивает скорость поглощения метотрексата.

Синтетический стероид дексаметазон мог быть замещен в сре­де инкубации на его природный аналог гидрокортизон, который вызывал примерно равное увеличение скорости поглощения мето­трексата. Это доказывает, что протективное действие на транспорт метотрексата производит не метаболизм гормона. Точно так же глюкагон мог быть замещен на изопротернол — активатор аденилатциклазы или на дибутирильный аналог циклического АМФ. Можно предполагать, что действие глюкагона на изучаемую транс­портную систему опосредовано через цАМФ, т.е. осуществляется на уровне плазматической мембраны клетки. Внесение в среду ин­кубации вместо токоферола другого мощного антиоксиданта — аскорбиновой кислоты — приводило к равнозначному эффекту.

Таким образом, указанные данные в совокупности позволяют предположить, что влияние гормонов и антиоксидантов на транс­порт метотрексата в гепатоцитах состоит в их общем стабилизи­рующем действии, а не в прямом взаимодействии с плазматической мембраной или возникновении промежуточных метаболитов, осу­ществляющих такое взаимодействие.

Преимущества, которые может дать использование изолирован­ных гепатоцитов в изучении процессов поглощения ксенобиотиков, видны, например, из работ Ивамото и соавторов с морфином и налорфином. Эти два широко используемые препарата характе­ризуются высокой скоростью выведения. Около 80% дозы этих ле­карств, введенных перорально, удаляется кишечником и печенью. Ранее было установлено, что печень играет более важную роль в фармакокинетике налорфина, чем кишечник, а для морфина имеет место противоположное соотношение, но причина этого различия оставалась непонятна. На изолированных гепатоцитах было пока­зано, что поглощение обоих веществ имеет активную и пассивную компоненту, причем активный транспорт, осуществляемый перенос­чиками, достигает насыщения при внеклеточной концентрации суб­стратов около 200мкМ. Поглощение чувствительно к метаболиче­ским ингибиторам, температурным изменениям и присутствию Na+ в среде. Так как оба препарата при физиологических значениях pH существуют в основном в катионной форме, можно предположить, что активный транспорт осуществляется описанной выше специализированной системой переноса органических катионов.

Скорость пассивной диффузии оценивалась по скорости погло­щения при концентрации, обеспечивающей насыщение активной компоненты. Сравнение отношения концентраций клетка/среда для морфина и налорфина обнаружило, что гепатоциты аккумулиру­ют налорфин в 3 раза быстрее, чем морфин; и хотя способность к конъюгации у налорфина тоже почти вдвое выше, чем у морфина, само по себе различие в конъюгирующей способности не может объяснить различия в скоростях их поглощения, так как накопление налорфина было в 3,2 раза выше даже в первые 5 минут, когда количество конъюгатов было незначительным.

Как показали расчеты, начальные скорости поглощения (которые тоже могут быть измерены только на изолированных клетках) обоих субстратов не зависели от скорости биотрансформации. Со­вокупность этих данных позволяет утверждать, что разница в величине клиренса этих ксенобиотиков в организме объясняется не различием в скорости их биотрансформации, а большей емкостью системы активного транспорта для налорфина в клетках печени.

Как уже упоминалось, связывание ксенобиотика с мембранами и внутриклеточными компонентами может сказываться на харак­тере их поглощения клеткой. Так, например, известно, что хлорпромазин — препарат, нашедший широкое применение в психотерапии, — легко связывается с клеточной мембраной. Отношение кон­центраций клетка/среда уже через 20 секунд после инкубации гепатоци­тов при сравнительно низких (10мкМ) концентрациях хлорпромазина превышало 30.

Показано, кроме того, что скорость накопления вещества в клет­ке мало изменялась под действием метаболических ингибиторов и линейно зависела от внеклеточной концентрации: насыщение на­ступало только при очень высоких концентрациях ксенобиотика в среде. Это говорит о том, что его проникновение в клетку подчиня­ется законам простой диффузии, а быстрое исчезновение из среды и аккумуляция против электрохимического градиента объясняются высокой способностью адсорбироваться на мембранах клетки.

Возможность быстрой аккумуляции химического соединения в клетке, обусловленной его взаимодействием с внутриклеточными компонентами, может быть продемонстрирована также на примере лидокаина — лекарственного средства, используемого для анесте­зии. После 2-минутной инкубации изолированных гепатоцитов с лидокаином отношение концентраций клетка/среда для этого суб­страта становится больше 7. Однако оно почти не меняется со вре­менем и при снижении температуры. Поглощение зависело от кон­центрации лидокаина. Метаболические ингибиторы не снижали ско­рость его накопления в клетках. Это доказывает, что проникнове­ние лидокаина в клетку есть диффузионный процесс, а аккумуля­ция против химического градиента объясняется внутриклеточным связыванием.

В числе задач, которые возникают при изучении транспорта ве­ществ в изолированных клетках, необходимо указать на необходи­мость исследований различий в характеристиках транспортных си­стем в перипортальных и центролобулярных гепатоцитах. Как уже указывалось, неоднородность расположения паренхиматозных кле­ток относительно центральных вен и желчных протоков приводит к гетерогенности в популяции гепатоцитов.

Эта гетерогенность прослеживается при сравнении многих по­казателей, характеризующих метаболический статус клетки, что определяется условиями снабжения клетки субстратами. В пользу этого свидетельствуют:

  1. результаты экспериментов с перфузи­руемой печенью, в которых показано, что метаболические свойства клеток обратимо меняются по мере их удаленности от места ввода перфузата;

  2. тот факт, что после часовой инкубации изолирован­ных гепатоцитов внутриклеточные концентрации ферментов во всех клетках становятся одинаковыми.

Несомненно, однако, и су­ществование конституционных отличий. Так, околопортальные клетки содержат больше липидов, имеют более развитый аппарат Гольджи, содержат больше пероксисом, но меньше митохондрий, чем околовенозные клетки. Околопортальные клетки имеют меньшую плотность, чем центролобулярные.

Морфологические и биохимические различия гепатоцитов, рас­положенных в разных зонах ацинуса, по-видимому, проявляются в различии характеристик транспорта некоторых субстратов в изо­лированные клетки.

Обнаружено различие в скорости поглощения некоторых ве­ществ, например оуабаина и таурохолата. Вместе с тем величины Км для них оказались примерно равными для обоих типов клеток. Поэтому можно предположить, что различия в скорости поглощения вызваны неодинаковым количеством переносчиков для отдельных субстратов в подфракциях гепатоцитов. В то же время галактоза поглощалась с одинаковой скоростью как перипортальными, так и перивенозными изолированными клетками. Таким об­разом, не все соединения транспортируются по-разному в ацинарно несимметричных клетках. Отметим также, что в условиях in vivo, несмотря на одинаковую скорость выведения галактозы из обоих типов клеток, ее аккумуляция в перипортальных клетках выше. Это означает, что при изоляции клеток характеристики системы пе­реноса галактозы меняются.

Наконец, надо отметить, что использование изолированных кле­ток печени позволило приступить к изучению механизма транспор­та ионов тяжелых металлов через плазматическую мембрану гепатоцитов. Эти исследования весьма актуальны для современной ток­сикологии, так как печень играет центральную роль в аккумуляции ионов металла, попадающих в организм. Как показали самые пер­вые эксперименты, существует несколько систем их переноса в клетках печени. Так, например, поглощение цинка гепатоцитами в первичной культуре зависит от температуры, характеризуется на­сыщением, ингибируется азидом, цианидом или олигомицином.

Синтетические аналоги стероидных гормонов, в частности дексаметазон, стимулировали (в отличие от кортизона и гидрокорти­зона) накопление цинка в клетках, но только в присутствии глюкатона или инсулина. Имеются все основания считать, что в печени трансмембранный перенос ионов цинка осуществляется ак­тивной, опосредуемой специализированными переносчиками систе­мой, которая хорошо сохраняется после изоляции клеток. Анало­гичные свойства описаны и для систем, транспортирующих цинк в другие клетки.

Более сложная зависимость показана для поглощения кадмия изолированных гепатоцитах. Стасей и Клаасен нашли, что у этого процесса можно выделить две фазы. Быстрое поглощение кадмия в первой фазе (10-15 мин) значительно снижается во второй. Ингибирование и разобщение окислительного фосфорилирова­ния мало влияли на обе фазы.

Предварительное введение животным хлористого цинка, много­кратно увеличивающего содержание металлтионинов — группы белков, связывающих металлические ионы в клетке, — увеличива­ло аккумуляцию кадмия в гепатоцитах только во время второй фазы. Это показывает, что в изолированных гепатоцитах поглоще­ние кадмия осуществляется с помощью облегченной диффузии в/или простой диффузии в первой фазе и определяется внутрикле­точным связыванием во второй.

Потоки этих веществ и in vivo и in vitro оказывают ингибирую­щее действие друг на друга, что указывает на существование об­щих путей переноса, хотя механизмы транспорта различны.

В настоящее время накоплено много данных, убедительно сви­детельствующих о том, что свойства плазматической мембраны изолированных гепатоцитов во многом идентичны свойствам мем­браны клеток in situ. Нативность выделенных клеток во многом определяется интактным состоянием их поверхности.

Исследование изолированных и культивируемых клеток печени открыло новые перспективы в изучении молекулярных и биохими­ческих аспектов функционирования механизмов основных феноме­нов клеточной физиологии — рецепции, адгезии, распознавании, эндоцитоза. Впервые появилась возможность изучения механизмов и кинетических характеристик транспортных систем, ответствен­ных за поглощение и экскрецию клеточных метаболитов, таких, как аминокислоты, гексозы, желчные кислоты и т.д.




© Авторы и рецензенты: редакционный коллектив оздоровительного портала "На здоровье!". Все права защищены.


 
Текст сообщения*
Защита от автоматических сообщений
Загрузить изображение
 

nazdor.ru
На здоровье!

Пользовательский поиск

Узнайте больше:

Гепатоциты как модель для изучения биотрансформации веществ


Гепатотоксичность ксенобиотиков и защитные механизмы клетки


Лимитирующие звенья монооксигеназных реакций в гепатоцитах


Биотрансформация этанола в изолированных гепатоцитах


Продукты гидроксилирования гидрофобных ксенобиотиков – стабилизаторы цитохрома Р-450 в гепатоцитах


Цитохром Р-450-зависимый метаболизм веществ в гепатоцитах


Метаболические параметры оценки жизнеспособности изолированных гепатоцитов


Количественные характеристики гепатоцитов


Роль гепатоцита в исследованиях печени


Механизмы деструкции цитохрома Р-450 в гепатоцитах


Всё на тему гепатоциты, ксенобиотики



Большинство диет для похудения просто крадут ваши деньги

Логин:

Пароль:



Забыли свой пароль?
Регистрация
войти / регистрация

Беременность | Лечение | Энциклопедия | Статьи | Врачи и клиники | Сообщество


О проектеКарта сайта β На здоровье! © 2008—2015
nazdor.ru, nazdor.com
Контакты Наш устав

Рекомендации и мнения, опубликованные на сайте, являются справочными или популярными и предоставляются широкому кругу читателей для обсуждения. Указанная информация не заменяет квалифицированную медицинскую помощь, основанную на истории болезни и результатах диагностики. Обязательно проконсультируйтесь с врачом.

Размещенные на сайте информационные материалы, включая статьи, могут содержать информацию, предназначенную для пользователей старше 18 лет согласно Федеральному закону №436-ФЗ от 29.12.2010 года "О защите детей от информации, причиняющей вред их здоровью и развитию".