Исследования транспорта ксенобиотиков в печени, почках, лимфоцитах и других клетках показали, что по крайней мере для некоторых из них существуют специальные системы переноса. Если эволюционный смысл существования особых транспортных систем для сахаров, аминокислот, жирных кислот и даже витаминов ясен, то целесообразность присутствия таких систем в клетках для веществ, поступление которых в организм не запрограммировано природой, во многом непонятно. Согласно одной из гипотез, перенос многих ксенобиотиков в клетку осуществляется теми же переносчиками, которые ответственны за транспорт аминокислот и сахаров.
Есть также предположение о существовании специфичных систем транспорта органических анионов, катионов и нейтральных молекул. Вероятно, что обе гипотезы отражают различные свойства одних и тех же транспортных систем, знание механизмов которых необходимо для решения обширного круга актуальных задач токсикологии, фармакокинетики и родственных направлений.
При изучении транспорта ксенобиотиков существуют общие проблемы. Интенсивность этого процесса оценивается по изменению внутриклеточной концентрации веществ. Стационарная концентрация вещества в клетке печени определяется соотношением скоростей следующих процессов:
- его транспорта через плазматическую мембрану из внеклеточной среды в клетку и в обратном направлении;
- метаболических превращений вещества в клетке;
- связывания вещества с внутриклеточными и мембранными компонентами;
- экскреции вещества из клетки.
Именно этим многообразием обусловлены трудности, возникающие при проведении экспериментальных работ в этой области.
Использование изолированных гепатоцитов для решения этих вопросов имеет свои преимущества и недостатки. С одной стороны, только на изолированных клетках можно провести измерение начальных скоростей переноса, знание которых нужно для получения кинетических характеристик. С другой стороны, при изоляции может произойти нарушение работы механизмов, ответственных, например, за выделение желчи, вызванное, в частности, морфологическими изменениями в экскреторных участках клеточной мембраны. Это, в свою очередь, может изменить баланс между входящим и выходящим потоками вещества.
Биотрансформация ксенобиотиков происходит в основном в гепатоцитах. Метаболиты, образующиеся при этом, и в первую очередь конъюгаты, могут ингибировать транспорт исходного вещества из клетки через базальную мембрану. Есть основания полагать, что скорость биотрансформации может лимитировать весь процесс. По этой же причине конъюгация затрудняет исследование механизмов экскреции. Способность многих ксенобиотиков связываться с белками клеточной мембраны или внутриклеточными компонентами мешает точному определению концентрации вещества в клетке и внеклеточном пространстве. Ее корректная количественная оценка практически осуществима только на изолированных клетках.
Для целого ряда ксенобиотиков показано существование активного переноса. Однако энергетика транспорта мало изучена. Как правило, большинство авторов ограничивается исследованием действия разобщителей и ингибиторов окислительного фосфорилирования на скорость переноса или накопления вещества в клетке или оценкой величины Na-зависимой компоненты транспорта.
Большое число экзогенных соединений попадает в печень в заряженной форме. Распределение этих веществ между клеткой и внешней средой зависит от величины мембранного потенциала. Однако только в единичных работах предпринята попытка установить связь между электрическим потенциалом на клеточной мембране и работой транспортных систем, осуществляющих перенос ксенобиотиков в клетки.
Наконец, знание особенностей трансцеллюлярного переноса оказывается крайне полезным при токсикологических исследованиях. Взаимодействие между различными соединениями на уровне клеточного поглощения может модифицировать токсическое или протектирующее действие некоторых препаратов. Примером может служить защитное влияние преинкубации гепатоцитов с трипсином против повреждающего действия фаллоидина. Сама по себе эта процедура приводит к повреждению клеточной мембраны за счет протеолитической активности этого фермента. Но взаимодействие трипсина с мембраной вызывает частичную инактивацию рецептора фаллоидина на внешней ее стороне, вследствие чего уменьшается поступление этого токсина в клетку.
Такая же картина наблюдалась при искусственно вызванном печеночном холестазе. Если перевязать желчный проток у крысы, то скорость поглощения фаллотоксинов значительно (на 75-85%) снижается в течение первых 2-4 часов и затем мало меняется в течение нескольких суток после перевязки. Это снижение наблюдалось в печени in vivo, в перфузируемой печени после наступления холестаза и в изолированных гепатоцитах, полученных у холестатических крыс.
Так как скорость поглощения токсинов уменьшается уже в ранние сроки, когда морфологические изменения клеточной мембраны под действием холестаза не успевают проявиться полностью, авторы заключили, что модификация транспорта этих веществ в клетку вызывался изменением концентрации солей желчных кислот, возникающих при холестазе.
Токсичность некоторых веществ может заключаться в их воздействии на транспортные системы клетки. Так, например, желчные кислоты ингибируют транспорт метотрексата; его поступление в клетки во время химиотерапии регулируется содержанием солей желчных кислот в печеночных синусоидах.
Проникновение большинства известных ксенобиотиков обусловлено, вероятно, простой диффузией. Однако для многих из них показано наличие транспортных систем, ответственных за перенос веществ через плазматическую мембрану. Ясно, что нельзя предполагать существование отдельных специализированных систем переноса для каждого соединения. По общему мнению исследователей, транспорт молекул чужеродных веществ осуществляется несколькими системами, специфичными к знаку заряда на этих молекулах. Поэтому для модельных экспериментов используется ограниченное количество маркерных субстратов, таких, как: бромсульфофталеин и его не метаболизирующийся в печени аналог — дибромсульфофталеин; индоциановый зеленый; флуоресцин; желчные кислоты; оуабаин и т.д.
При изучении системы, ответственной за транспорт органических анионов в гепатоцитах, чаще всего используются бромсульфофталеин и его аналоги. Существуют противоречивые данные о характере транспорта бромсульфофталеина через плазматическую мембрану. В большинстве работ приведены доказательства того, что проникновение этого ксенобиотика в клетку происходит по типу облегченной диффузии (пассивный транспорт). В то же время известна чувствительность транспорта этого вещества к метаболическим ингибиторам, что указывает на энергозависимость процесса поглощения. Возможно, что одной из причин появления противоречивых данных служит маскирующее влияние образующихся конъюгатов и связывание самого вещества с внеклеточными белками. Для дибромсульфофталеина было показано, что скорость его поглощения зависит от внеклеточной концентрации белка и описывается кинетикой Михазлеса – Ментон. Транспортная система для дибромсульфофталеина имеет энергозависимую и неэнергозависимую компоненты и не зависит от концентраций ионов натрия. Оба аналога имеют по два места связывания на плазматической мембране с различным сродством: 4,8 и 70мкМ для бромсульфофталеина и 1,3 и 48мкМ для дибромсульфофталеина. Выход из клетки последнего лишь незначительно зависит от энергетических затрат, но не от концентрации ионов Na+. Выделение дибромсульфофталеина с желчью лимитирует также транспорт этого соединения из клетки; в изолированных гепатоцитах способность к его секреции частично снижена. Поглощение дибромсульфофталеина может идти и против электрохимического градиента.
Транспорт бромсульфофталеина, так же как и некоторых других органических анионов, из клетки в желчь является активным процессом, который тоже идет против электрохимического градиента. Конъюгация бромсульфофталеина с внутриклеточным глютатионом не влияет, по-видимому, на скорость поступления в клетку, но уменьшает скорость его выхода из клетки.
Наиболее часто используется в модельных экспериментах электрически нейтральное соединение — оуабаин. Это вещество не метаболизируется и не связывается с внутриклеточными белками. Поглощение оуабаина в изолированных гепатоцитах — энергозависимый процесс, чувствительный к ингибитору SH-групп. Цианид снижает скорость поступления ксенобиотиков в клетку на 40%, ротенон — на 60%, 2,4-динитрофенол — на 90%. Небольшое ингибирование (15%) отмечалось при понижении температуры от 37 до 27°С. Перенос оуабаина через клеточную мембрану внутрь клетки не зависит от внеклеточной концентрации катионов и pH и может идти против градиента концентрации. Отношение концентраций клетка – среда для оуабаина достигает 170. Замена натрия на холин не влияет на скорость поглощения оуабаина. Органические анионы (бромсульфофталеин, индоциановый зеленый и др.) не оказывают ингибирующего действия на транспорт оуабаина, тогда как сердечные гликозиды и некоторые гормоны уменьшают скорость его всасывания гепатоцитами.
Выход оуабаина из гепатоцитов не связан с его поглощением, нуждается в метаболической энергии, но не зависит от концентрации SH-групп в клетках. Есть основания полагать, что транспорт оуабаина опосредован переносчиком стероидов в клетке.
Способность гепатоцитов к поглощению желчных кислот является важным показателем их функциональной активности. По данным кинетического анализа транспорт желчных кислот осуществляется двумя системами одновременно — активной (насыщаемой) и пассивной, работающей по типу простой диффузии (ненасыщаемой). Активная компонента транспорта таурохолата— наиболее часто используемого маркерного субстрата систем переноса желчных кислот — чувствительна к натрию .
Концентрация желчных кислот в крови здорового организма — 60мкМ, диффузионная компонента в норме играет незначительную роль. Однако при некоторых патологиях концентрация таурохолата может увеличиться до 100мкМ и соответственно возрастает значение простой диффузии. Скорость (но не Км) транспорта таурохолата уменьшается в присутствии аминокислот, переносимых Na-зависимым путем, и не меняется при внесении субстратов Na- независимых систем. Скорость активного транспорта желчных кислот зависит от их химического строения (числа гидроксильных групп) и для дигидрооксихолиевых кислот выше, чем для тригидрооксихолиевых, имеющих более высокое сродство. В изолированных клетках скорость выведения таурохолата может служить характеристикой секреции желчных кислот. Было показано, что экскреция таурохолата — энергозависимый, насыщаемый процесс, очень чувствительный к антимицину А.
Кинетический анализ и изучение действия ингибиторов показывают, что секреция желчных кислот в изолированных клетках печени хорошо сохраняется.
Очень интересные и важные результаты были получены Блюмом с соавторами. Ими было проведено сравнительное изучение скорости поглощения трех маркерных органических субстратов — аниона (дибромсульфофталеина), катиона (d-тубокурарина) и нейтрального соединения (оуабаина) — одновременно на трех моделях: целом организме, перфузируемой печени и изолированных клетках. Экспериментально полученные значения скорости поглощения этих веществ клеткой и экскреции из нее были скорректированы с учетом скорости кровотока (перфузата в печени) и количества субстрата, связанного с внеклеточными белками. Скорость исчезновения из внешней среды для дибромсульфофталеина и оуабаина при инкубации с изолированными клетками в 2-3 раза меньше, чем в интактном органе. В изолированных гепатоцитах снижена (по сравнению с in vivo) скорость секреции d-тубокурарина и оуабаина. Скорость секреции из клеток дибромсульфофталеина и поглощение клетками d-тубокурарина практически не изменялись. Таким образом, имеющиеся в литературе данные подтверждают наличие хорошего качественного совпадения характеристик транспортных систем изолированных клеток печени и целой печени.
Ключом к пониманию природы наблюдаемых для этих моделей количественных различий в скоростях поглощения могут служить результаты, полученные при изучении транспорта метотрексата. Предполагается, что перенос метотрексата осуществляется той же системой, что и перенос таурохолата. Она имеет две компоненты: одну с высоким сродством к субстрату, вторую — с низким, частично насыщаемую. Обе компоненты чувствительны к метаболическим ингибиторам и зависят от температуры, что указывает на активный характер переноса этого ксенобиотика. Скорость поглощения метотрексата клетками в монослойной культуре меньше, чем целой печенью. С увеличением срока культивирования (от 24 до 48 часов) наблюдается дальнейшее снижение скорости поглощения.
Снижение скорости транспорта метотрексата невозможно объяснить ухудшением мембранной проницаемости. Более естественной выглядит гипотеза авторов о том, что наблюдаемый эффект вызван изменением гормонального баланса в клеточном окружении.
Действительно, добавка каждого из гормонов — D-гексаметазона, глюкагона, а также альфа-токоферола в среду инкубации стабилизирует мембраны и значительно (в среднем на 250%) увеличивает скорость поглощения метотрексата.
Синтетический стероид дексаметазон мог быть замещен в среде инкубации на его природный аналог гидрокортизон, который вызывал примерно равное увеличение скорости поглощения метотрексата. Это доказывает, что протективное действие на транспорт метотрексата производит не метаболизм гормона. Точно так же глюкагон мог быть замещен на изопротернол — активатор аденилатциклазы или на дибутирильный аналог циклического АМФ. Можно предполагать, что действие глюкагона на изучаемую транспортную систему опосредовано через цАМФ, т.е. осуществляется на уровне плазматической мембраны клетки. Внесение в среду инкубации вместо токоферола другого мощного антиоксиданта — аскорбиновой кислоты — приводило к равнозначному эффекту.
Таким образом, указанные данные в совокупности позволяют предположить, что влияние гормонов и антиоксидантов на транспорт метотрексата в гепатоцитах состоит в их общем стабилизирующем действии, а не в прямом взаимодействии с плазматической мембраной или возникновении промежуточных метаболитов, осуществляющих такое взаимодействие.
Преимущества, которые может дать использование изолированных гепатоцитов в изучении процессов поглощения ксенобиотиков, видны, например, из работ Ивамото и соавторов с морфином и налорфином. Эти два широко используемые препарата характеризуются высокой скоростью выведения. Около 80% дозы этих лекарств, введенных перорально, удаляется кишечником и печенью. Ранее было установлено, что печень играет более важную роль в фармакокинетике налорфина, чем кишечник, а для морфина имеет место противоположное соотношение, но причина этого различия оставалась непонятна. На изолированных гепатоцитах было показано, что поглощение обоих веществ имеет активную и пассивную компоненту, причем активный транспорт, осуществляемый переносчиками, достигает насыщения при внеклеточной концентрации субстратов около 200мкМ. Поглощение чувствительно к метаболическим ингибиторам, температурным изменениям и присутствию Na+ в среде. Так как оба препарата при физиологических значениях pH существуют в основном в катионной форме, можно предположить, что активный транспорт осуществляется описанной выше специализированной системой переноса органических катионов.
Скорость пассивной диффузии оценивалась по скорости поглощения при концентрации, обеспечивающей насыщение активной компоненты. Сравнение отношения концентраций клетка/среда для морфина и налорфина обнаружило, что гепатоциты аккумулируют налорфин в 3 раза быстрее, чем морфин; и хотя способность к конъюгации у налорфина тоже почти вдвое выше, чем у морфина, само по себе различие в конъюгирующей способности не может объяснить различия в скоростях их поглощения, так как накопление налорфина было в 3,2 раза выше даже в первые 5 минут, когда количество конъюгатов было незначительным.
Как показали расчеты, начальные скорости поглощения (которые тоже могут быть измерены только на изолированных клетках) обоих субстратов не зависели от скорости биотрансформации. Совокупность этих данных позволяет утверждать, что разница в величине клиренса этих ксенобиотиков в организме объясняется не различием в скорости их биотрансформации, а большей емкостью системы активного транспорта для налорфина в клетках печени.
Как уже упоминалось, связывание ксенобиотика с мембранами и внутриклеточными компонентами может сказываться на характере их поглощения клеткой. Так, например, известно, что хлорпромазин — препарат, нашедший широкое применение в психотерапии, — легко связывается с клеточной мембраной. Отношение концентраций клетка/среда уже через 20 секунд после инкубации гепатоцитов при сравнительно низких (10мкМ) концентрациях хлорпромазина превышало 30.
Показано, кроме того, что скорость накопления вещества в клетке мало изменялась под действием метаболических ингибиторов и линейно зависела от внеклеточной концентрации: насыщение наступало только при очень высоких концентрациях ксенобиотика в среде. Это говорит о том, что его проникновение в клетку подчиняется законам простой диффузии, а быстрое исчезновение из среды и аккумуляция против электрохимического градиента объясняются высокой способностью адсорбироваться на мембранах клетки.
Возможность быстрой аккумуляции химического соединения в клетке, обусловленной его взаимодействием с внутриклеточными компонентами, может быть продемонстрирована также на примере лидокаина — лекарственного средства, используемого для анестезии. После 2-минутной инкубации изолированных гепатоцитов с лидокаином отношение концентраций клетка/среда для этого субстрата становится больше 7. Однако оно почти не меняется со временем и при снижении температуры. Поглощение зависело от концентрации лидокаина. Метаболические ингибиторы не снижали скорость его накопления в клетках. Это доказывает, что проникновение лидокаина в клетку есть диффузионный процесс, а аккумуляция против химического градиента объясняется внутриклеточным связыванием.
В числе задач, которые возникают при изучении транспорта веществ в изолированных клетках, необходимо указать на необходимость исследований различий в характеристиках транспортных систем в перипортальных и центролобулярных гепатоцитах. Как уже указывалось, неоднородность расположения паренхиматозных клеток относительно центральных вен и желчных протоков приводит к гетерогенности в популяции гепатоцитов.
Эта гетерогенность прослеживается при сравнении многих показателей, характеризующих метаболический статус клетки, что определяется условиями снабжения клетки субстратами. В пользу этого свидетельствуют:
- результаты экспериментов с перфузируемой печенью, в которых показано, что метаболические свойства клеток обратимо меняются по мере их удаленности от места ввода перфузата;
- тот факт, что после часовой инкубации изолированных гепатоцитов внутриклеточные концентрации ферментов во всех клетках становятся одинаковыми.
Несомненно, однако, и существование конституционных отличий. Так, околопортальные клетки содержат больше липидов, имеют более развитый аппарат Гольджи, содержат больше пероксисом, но меньше митохондрий, чем околовенозные клетки. Околопортальные клетки имеют меньшую плотность, чем центролобулярные.
Морфологические и биохимические различия гепатоцитов, расположенных в разных зонах ацинуса, по-видимому, проявляются в различии характеристик транспорта некоторых субстратов в изолированные клетки.
Обнаружено различие в скорости поглощения некоторых веществ, например оуабаина и таурохолата. Вместе с тем величины Км для них оказались примерно равными для обоих типов клеток. Поэтому можно предположить, что различия в скорости поглощения вызваны неодинаковым количеством переносчиков для отдельных субстратов в подфракциях гепатоцитов. В то же время галактоза поглощалась с одинаковой скоростью как перипортальными, так и перивенозными изолированными клетками. Таким образом, не все соединения транспортируются по-разному в ацинарно несимметричных клетках. Отметим также, что в условиях in vivo, несмотря на одинаковую скорость выведения галактозы из обоих типов клеток, ее аккумуляция в перипортальных клетках выше. Это означает, что при изоляции клеток характеристики системы переноса галактозы меняются.
Наконец, надо отметить, что использование изолированных клеток печени позволило приступить к изучению механизма транспорта ионов тяжелых металлов через плазматическую мембрану гепатоцитов. Эти исследования весьма актуальны для современной токсикологии, так как печень играет центральную роль в аккумуляции ионов металла, попадающих в организм. Как показали самые первые эксперименты, существует несколько систем их переноса в клетках печени. Так, например, поглощение цинка гепатоцитами в первичной культуре зависит от температуры, характеризуется насыщением, ингибируется азидом, цианидом или олигомицином.
Синтетические аналоги стероидных гормонов, в частности дексаметазон, стимулировали (в отличие от кортизона и гидрокортизона) накопление цинка в клетках, но только в присутствии глюкатона или инсулина. Имеются все основания считать, что в печени трансмембранный перенос ионов цинка осуществляется активной, опосредуемой специализированными переносчиками системой, которая хорошо сохраняется после изоляции клеток. Аналогичные свойства описаны и для систем, транспортирующих цинк в другие клетки.
Более сложная зависимость показана для поглощения кадмия изолированных гепатоцитах. Стасей и Клаасен нашли, что у этого процесса можно выделить две фазы. Быстрое поглощение кадмия в первой фазе (10-15 мин) значительно снижается во второй. Ингибирование и разобщение окислительного фосфорилирования мало влияли на обе фазы.
Предварительное введение животным хлористого цинка, многократно увеличивающего содержание металлтионинов — группы белков, связывающих металлические ионы в клетке, — увеличивало аккумуляцию кадмия в гепатоцитах только во время второй фазы. Это показывает, что в изолированных гепатоцитах поглощение кадмия осуществляется с помощью облегченной диффузии в/или простой диффузии в первой фазе и определяется внутриклеточным связыванием во второй.
Потоки этих веществ и in vivo и in vitro оказывают ингибирующее действие друг на друга, что указывает на существование общих путей переноса, хотя механизмы транспорта различны.
В настоящее время накоплено много данных, убедительно свидетельствующих о том, что свойства плазматической мембраны изолированных гепатоцитов во многом идентичны свойствам мембраны клеток in situ. Нативность выделенных клеток во многом определяется интактным состоянием их поверхности.
Исследование изолированных и культивируемых клеток печени открыло новые перспективы в изучении молекулярных и биохимических аспектов функционирования механизмов основных феноменов клеточной физиологии — рецепции, адгезии, распознавании, эндоцитоза. Впервые появилась возможность изучения механизмов и кинетических характеристик транспортных систем, ответственных за поглощение и экскрецию клеточных метаболитов, таких, как аминокислоты, гексозы, желчные кислоты и т.д.