Плазматическая мембрана — полупроницаемый барьер между клеткой и внешней средой — является очень сложным в биохимическом и морфологическом отношениях образованием, способным к динамической перестройке. Она неразрывно связана в единый функциональный комплекс с цитоструктурами, образующими внешнюю клеточную поверхность, которая включает в себя внутренний примембранный слой, собственно плазматическую мембрану и гликокаликс. Разделение функций между мембраной и прилегающими к ней структурами зачастую является условным, и понятие о функциональной активности плазматической мембраны целесообразно относить ко всей клеточной поверхности, контролирующей многие жизненно важные функции клетки. В выполнении одних функций молекулы, расположенные на поверхности клетки, участвуют непосредственно, других — опосредованно, участвуя в обеспечении проницаемости, композиции и стабилизации плазматической мембраны. Рецепторы плазматической мембраны, взаимодействующие с внешними лигандами, рецепторами других клеток и внеклеточным матриксом, функционально связаны с внутриклеточными структурами. Способность цитоскелетных систем контролировать распределение и динамику рецепторов клеточной поверхности, обусловленная передачей сигналов от цитоплазматических структур к плазматической мембране через мембраносвязанные элементы цитоскелета, объясняет центральную роль указанного комплекса во многих процессах, из которых наиболее важные:
- межклеточные взаимодействия,
- клеточная рецепция,
- транспорт вещества через плазматическую мембрану клеток.
Исторически сложилось, что основные исследования в этой области цитофизиологии были выполнены на бактериях, свободноживущих в эпителиальных клетках.
Несмотря на универсальность многих процессов в клетках разных типов, о полной их тождественности говорить нельзя. Возможность получения нового биологического объекта — суспензии изолированных гепатоцитов — стимулировала появление многочисленных работ, посвященных молекулярным и биохимическим аспектам функционирования плазматических мембран клеток паренхимы печени. Ниже изложены результаты наиболее важных и интересных исследований в этой области цитофизиологии, выполненных на изолированных клетках печени.
При обсуждении свойств плазматической мембраны изолированных гепатоцитов следует учесть несколько замечаний общего характера. Прежде всего при выделении клеток возможно повреждение плазматической мембраны. После выделения гепатоцит в отличие от состояния in situ окружен средой инкубации и лишь в отдельных случаях контактирует с другими клетками. Это не может не отразиться на свойствах клеточной поверхности. От условий изоляции может существенно зависеть метаболическое состояние клетки. В то же время хорошо известно, что энергетика и редокс-статус клетки, локализация ионов и распределение метаболитов в компартментах являются факторами, контролирующими организацию цитоскелета и, опосредованно, клеточной поверхности. Это еще раз напоминает о необходимости тщательного контроля как за процессом изоляции гепатоцитов, так и за их функциональным состоянием при инкубации или культивировании.
Адгезия и агрегация изолированных гепатоцитов
Под адгезивными свойствами клеток подразумевается их способность связываться с соседними клетками или различными субстратами биологического и небиологического происхождения. Адгезивные свойства гепатоцитов начали изучать лишь в конце 70-х годов. Так как эти свойства непосредственно зависят от состояния наружной поверхности плазматической мембраны и состава внеклеточной среды, даже небольшие изменения в методе выделения клеток могут вызвать большие различия в поведении последних и будут отражаться на состоянии поверхности гепатоцитов.
Так, например, ферментативно полученные клетки из механически измельченной печени образовывали в течение первых 20 минут инкубации при 37°С почти вдвое больше агрегатов, чем клетки, выделенные по методу Сеглена. Скорость реагрегации клеток в данном случае может характеризовать изменение их адгезивных свойств. Подобные же отличия наблюдались и для гель-связывающей активности клеток. По мнению авторов, эти явления объясняются действием агентов (протеазы, гиалидазы и т.д.), освобождающихся в ходе изоляции и заметно изменяющих поверхностные свойства клеток.
Как уже говорилось, клетки печени in situ имеют три границы контактов. После же изоляции все участки клеточной поверхности имеют одинаковое окружение. Уже через 30 минут после изоляции гепатоциты становятся более округлыми, а клеточная поверхность однородной. После нескольких часов инкубации гепатоциты начинают агрегировать в группы по 2-4 клетки и возникают первые межклеточные соединения. В процессе культивирования распластавшиеся гепатоциты (в присутствии синусоидальных клеток) «восстанавливают» клеточные трабекулы, желчные протоки и, частично, структуру межклеточных контактов, характерную для интактной печени.
Имеются доказательства, что в межклеточной адгезии гепатоцитов, так же как и в других клетках, активное участие принимают гликопротеиды с молекулярным весом 68 000 - 150 000.
По-видимому, гликопротеиды ответственны не только за взаимодействие гепатоцитов с коллагеновым матриксом, но и за межклеточную адгезию. Полное распластывание может наступить уже через 5-10 часов инкубации при наличии всех необходимых ингредиентов. Показано, что это возможно только в присутствии коллагена или фибронектина в отличие от простой адгезии изолированных гепатоцитов. Структура фибронектина окончательно не установлена. Известны два его типа, причем оба белка имеют сходные характеристики. Один из них обнаруживается преимущественно в крови — плазмафибронектин. Второй найден на клеточной поверхности — клеточный фибронектин. Изолированные гепатоциты в процессе инкубации или культивирования секретируют в основном первую форму фибронектииа, и скорость синтеза обеспечивает его внутриклеточную концентрацию, показанную для печени.
Прикрепление и распластывание гепатоцитов в присутствии фибронектина зависит от концентрации последнего и максимально, когда его содержание достигает 10 мкг/мл. Так как распластывание существенно для многих внутриклеточных процессов (синтез ДНК, РНК, пролиферация и др.), можно думать, что фибронектин и коллаген нужны для образования клеточного матрикса. Фибронектин опосредует распластывание только живых клеток. Он устойчив к коллагеназе, но неустойчив к трипсину.
Установлено, что сыворотка плазмы крови содержит и другой, помимо фибронектина, фактор, влияющий на адгезивные свойства клеток печени. В чашках Петри, покрытых фибронектином, изолированные гепатоциты сохраняют способность прикрепляться и распластываться в среде, не содержащей сыворотку, в течение 2 суток. Для увеличения срока культивирования введение сыворотки в состав инкубационной среды обязательно.
Для изучения межклеточной адгезии гепатоцитов часто используют антитела к клеточной поверхности. Показано, что антитела к изолированным плазматическим мембранам печени крысы ингибируют прикрепление гепатоцитов к коллагену, но для фибронектина они неэффективны. Кроличьи антитела к фибронектину крысы ингибировали адгезию гепатоцитов к фибронектину крысы и не влияли на адгезию к коллагену или фибронектину, выделенному от кролика. Такие различные эффекты антител на адгезию гепатоцитов к фибронектину и коллагену дают основание считать, что за прикрепление гепатоцитов к этим веществам ответственны различные компоненты клеточной поверхности. Это же относится и к межклеточной адгезии. Ингибирование адгезии к субстратам снимается при добавлении к суспензии гепатоцитов растворимых компонентов клеточной оболочки, что также позволяет предполагать наличие рецепторов к коллагену и фибронектину на внешней поверхности изолированных клеток печени. Роль фибронектина в межклеточных взаимодействиях еще недостаточно ясна.
Для понимания принципов межклеточной организации в многоклеточных образованиях крайне важно и изучение молекулярных механизмов узнавания клеткой — клетки и клеткой — субстрата. Гепатоциты, изолированные из печени разных животных, обладают способностью к сортировке. Если смешать гепатоциты, полученные из печени крысы и цыпленка, образование агрегатов между гомологичными клетками идет намного быстрее, чем между клетками различных видов. Проявление этого эффекта в значительной степени зависит от наличия адгезионных факторов в инкубационной среде. Так, при добавлении в среду инкубации сыворотки цыпленка или сыворотки теленка видовая специфичность выражена заметно, а в присутствии сыворотки крысы, эмбриональной сыворотки теленка или в среде без сыворотки адгезия была неспецифичной.
Агрегация клеток является сложным многоэтапным процессом, в котором взаимодействие рецепторов плазматических мембран агрегирующих клеток, — по-видимому, наиболее ответственный момент.
Известно, что агрегация регулируется дивалентными катионами. Максимальная скорость адгезии гепатоцитов из печени крысы развивалась в присутствии ионов Mg2+, тогда как гепатоциты из печени цыпленка требовали присутствия Са2+. Последний индуцировал неспецифическую адгезию этих двух типов клеток. Предполагается, что неспецифичная адгезия, индуцируемая Са2+, опосредована через углеводсвязывающие белки. Са2+ активирует углеводсвязывающие рецепторы на внешней стороне плазматической мембраны гепатоцитов крысы и делает возможным их взаимодействие с глюкоконъюгатами, содержащими галактозные остатки на поверхности гепатоцитов. Существование такого механизма подтверждается тем, что при добавлении сыворотки, содержащей подобные глюкоконъюгаты, неспецифическая адгезия блокируется.
Для гепатоцитов молодых крыс и цыплят была показана специфичность адгезивных свойств клетки. При совместной инкубации изолированных гепатоцитов и миоцитов, полученных от одного животного, при 37°С в течение 40 минут более 90% агрегатов включали гомологичные клетки. Это же наблюдалось при изменении ионного состава среды, условий перемешивания и т.п. По мнению авторов, результаты свидетельствуют о существовании различных рецепторов на поверхности клетки, отвечающих за адгезию и узнавание клетки клеткой. В межклеточной адгезии могут участвовать и общие компоненты, но вряд ли они определяют специфичность этого процесса.
Агрегация гепатоцитов как крыс, так и цыплят заметно усиливалась при добавлении фракций плазматических мембран печени крысы, причем образование агрегатов зависело от концентрации добавленных мембран. Дивалентные катионы Са2+ и Mg2+ действовали так же, как и в упомянутых выше опытах по совместной инкубации гепатоцитов разных животных: Са2+ специфично стимулировал агрегацию гепатоцитов цыпленка, a Mg2+ в физиологической концентрации обеспечивал оптимальную скорость агрегации только гепатоцитов крыс. Было показано, что такое действие плазматических мембран связано с участием поверхностных гликопротеидов. Совокупность этих работ свидетельствует, что адгезивные свойства, присущие гепатоцитам in situ, сохраняются и в условиях in vitro.
При изучении взаимодействия изолированных гепатоцитов с гелем, образованным углеводами, удалось подтвердить существование углеводспецифичной адгезии клеток. Адгезионные свойства гепатоцитов крысы и кролика зависят от температуры инкубации. При 37°С после 10-20-минутного латентного периода сила прикрепления к гелю возрастала более чем в 15 раз. Это увеличение не наблюдалось при инкубации при 4°С. Ингибиторы окислительного фосфорилирования олигомицин и ротенон в концентрациях, снижающих уровень АТФ до 5% от начального уровня, значительно (в 5-6 раз) ослабляли силу прикрепления клеток к гелю. Это доказывает энергозависимый характер адгезионных процессов.
Изолированные гепатоциты крысы и цыпленка строго избирательно связывались с галактозой и N-ацетилглюкозамином, т.е. они обладали способностью распознавать и вступать во взаимодействие с определенными углеводами, располагающимися на поверхности клетки. Моно- и дисахариды, иммобилизованные на неорганической поверхности, опосредуют специфичную адгезию интактных изолированных клеток печени крыс и цыпленка к адсорбированным гликолипидам, входящим в комплекс сахаров с гликолипидами на поверхности соответствующих клеток.
Гепатоциты специфично взаимодействуют и с синтетическими гликолипидами, адсорбированными на геле. Специфичная адгезия охватывает до 90% всей популяции, слабо зависит от pH в диапазоне величин 6,6 - 8,6 и развивается в течение 20-25 минут.
В процессе связывания клеток с углеводами может происходить изменение клеточной поверхности за счет модификации углеводных остатков. Действительно, раствор углевода, который омывал клетки в геле, полностью обращал эффект адгезии при 4°С или при кратковременном (менее 30 минут) его действии при 37°С. Но если в последнем случае это действие продолжалось более 60 минут, влияния на клеточную адгезию не наблюдалось. Метаболические же ингибиторы, которые блокируют усиление адгезии между клетками и гелем, не влияют на резистентную к отмывке сахаром адгезионную способность интактных гепатоцитов. Это указывает, что модификация углеводов в геле происходит с участием мембраносвязанных ферментов клетки.
Таким образом, совпадение закономерностей, наблюдаемых при взаимодействиях клетка — субстрат и клетка — клетка, дает основание предполагать, что в изолированных гепатоцитах сохраняется функция мембранных рецепторов и эти клетки являются удобной моделью для проведения экспериментов по изучению физиологической роли рецепторов углеводов. При этом, конечно, надо учитывать, что в процессе инкубации и, особенно, культивирования клетки могут выработать свою адаптивность в адгезионных или рецепторных свойствах.
