Пользовательский поиск

Методы регистрации метаболизма гидроперекисей в гепатоцитах

Для определения интенсивности процессов метаболизма гидроперекисей в арсенале исследователей имеется целый ряд различных методов.

Продолжение ниже

Рак молочной железы - лечение

... Сахароснижающие препараты Термотерапия Лен Иммунотерапия Терапия дендритными клетками Стивумакс – лечение гормональнозависимых опухолей (III фаза ... ... симпозиуме «Рак молочной железы» в Сан-Антонио прозвучал доклад о метаболизме эстрогенов. Приблизительно у трети от 66 участниц исследования ...

Читать дальше...

всё на эту тему


К наиболее широко применяемым способам качественной и ко­личественной регистрации H2O2 относится определение равновес­ий концентрации комплекса каталазы с перекисью водорода — так называемый комплекс 1. Этот метод, разработанный Ошино с соавторами, основан на том факте, что равновесная концентрация комплекса 1 зависит от общего количества каталазы, скорости генерации перекиси и концентрации донора водорода. Регистрируя изменение спектра поглощения в области λ = 630-660нм (двухволновая спектрофотометрия) при добавлении донора водорода, можно рассчитать скорость образования H2O2. В качестве донора водорода предпочтительнее исполь­зовать метанол, так как он не является субстратом для НАД-зависимых дегидрогеназ. Метод имеет широкую область примене­ния, в том числе используется и для суспензии изолированных кле­ток печени. Однако необходимо отметить, что регистрация комплекса 1 позволяет наблюдать за количественными изменения­ми только той перекиси, которая поступает в компартменты, со­держащие каталазу, и не учитывает катаболизма H2O2 в других системах.

Высокое содержание каталазы в клетках печени, а также ее способность разлагать перекись водорода с выделением кислорода делает возможным использовать полярографический метод для оценки активности различных путей утилизации H2O2. Добавляя к клеткам печени экзогенную перекись водорода и учитывая, что на 2 моля H2O2 при полном разложении ее по каталазному пути выделяется 1 моль кислорода, можно оценить интенсивность дру­гих перекисьутилизирующих систем. Уникальную способ­ность каталазы разлагать перекись водорода до О3 и Н2О можно использовать для оценки интенсивности ее выделения во внекле­точную среду при добавлении в среду инкубации гепатоцитов эк­зогенного фермента либо его ингибиторов.

Катаболизм гидроперекисей цитозольного и митохондриального пула можно изучать по скорости окисления GSH и/или выделения из клеток GSSG, так как эти метаболиты входят в систему взаи­модействия пероксидаз с гидроперекисями. В этом случае необходимо иметь в виду, что основная часть окисленного глутатиона восстанавливается под действием НАДФН-глутатионредуктазы. Следовательно, не всегда скорость выделения окисленного глутатиона соответствует истинной скорости разложения гидроперекисей. Несмотря на это, метод достаточно информативен и широко распространен в практике исследования метаболизма гидроперекисей в различных клетках, в том числе и в гепатоцитах. Наличие сопряжения глутатионпероксидазной и НАДФН-зависимой глутатионредуктазной активности может служить источником дополнительной информации о процессах метаболизма гидроперекисей в гепатоцитах. В этом случае изме­нение скорости окисления пиридиннуклеотида является отражени­ем скорости пероксидазного пути утилизации гидроперекиси.

В связи с тем что продукты промежуточного метаболизма кис­лорода недовосстановлены, представляет интерес метод оценки ин­тенсивности перекисьобразования и с использованием флуорес­центных доноров водорода для восстановления гидроперекисей. К числу таких соединений относится скополетин (7-гидрокси-6- метоксикумарин). Это соединение является донором водорода для пероксидазы хрена при восстановлении перекиси водорода

При этом окисление скополетина сопровождается потерей способности флуоресцировать.

Так как стехиометрия процесса равна 1:1, а интенсив­ность флуоресценции прямо пропорциональна концентрации вос­становленного скополетина, то по уменьшению флуоресценции в единицу времени можно рассчитать скорость его окисления и, сле­довательно, скорость генерации гидроперекиси. Согласно данным литературы, метод использовался как применительно к субклеточ­ным фракциям, так и при работе с клетками лимфоидного ряда, стимуляция которых соответствующими агентами приводит к интенсивному выделению H2O2 в экстрацеллюлярную среду. В обоих случаях производилась оценка скорости генерации той перекиси, которая восстанавливалась скополетином в присут­ствии экзогенно добавляемой пероксидазы хрена.

Однако на изолированных клетках было отмечено спонтанное окисление скополетина, что объяснялось участием в этом процес­се эндогенной миелопероксидазы. При оценке метаболизма гидроперекисей в суспензии гепатоцитов с помощью данного ме­тода нами также был отмечен факт эндогенного окисления флуо­ресцентного донора водорода. В результате экспериментальной проверки было установлено, что этот процесс объясняется окисле­нием скополетина при восстановлении гидроперекисей эндогенны­ми пероксидазами. Проникая внутрь клетки, скополетин включа­ется в катаболизм гидроперекисей в системе эндоплазматических пероксидаз, интенсивность работы которых зависит от активности процессов, генерирующих перекись. К сожалению, поскольку глутатионпероксидаза способна восстанавливать как Н2О2, так и ор­ганические гидроперекиси, метод не позволяет оценить активность генерации отдельных метаболитов кислорода и является интеграль­ным показателем состояния перекисьобразующих систем.

Достоинством данного метода является возможность непрерыв­ной и одновременной регистрации активности пероксидазной ре­акции и скорости утилизации кислорода, что достигается примене­нием комбинированной флуоресцентно-полярографической установки. Поскольку окисления скополетина биологическим объектом в отсутствии кислорода не наблюдается (нет образования кислородсодержащих перекисных частиц), регистрация сразу двух про­цессов позволяет ввести дополнительный показатель перекисьобразования — долю О2, используемую для окисления скополетина. По этому показателю можно опосредованно, через активность катаболизма перекисей, судить о потоке кислорода, идущего на генерацию гидроперекисей. Таким образом, запись кинетики флуоресценции скополетина в присутствии биологического объекта позволяет вести мониторинг метаболизма гидроперекисей.

Для изучения метаболизма свободнорадикальных частиц, в частности супероксидного аниона, используют способность О2 вос­станавливать ряд соединений. При этом меняются их спектральные характеристики. Например, восстановление супероксидом цито­хрома с приводит к уменьшению поглощения в области λ = 550-540нм (двухволновая спектрофотометрия). Поскольку часть супероксидного аниона может выходить за пределы клетки, этот метод применим и для суспензии клеток печени. Особенно эффективен он при использовании искусственных дериватов цитохрома с — ацетилированной или сукцинатной его форм, по­скольку в таком виде он малореактивен — с другими восстанавли­вающими агентами, например флавинзависимыми цитохром с-редуктазами.

При измерении в биологических системах синглетного кислорода определенные трудности возникают в связи с тем, что период полураспада этой частицы очень мал: в водных растворах он равен примерно 2мкс. Переходя в основное, триплетное состояние, отдает энергию в виде кванта света:

1О2 + 1О2 = 23О2 + hv.

Регистрируя это свечение и проводя спектральный анализ хемилюминесценции, можно идентифицировать синглетный кисло­род. Пики излучения для О2 находятся в области λ = 570-580; 634; 703; 1070 и 1269нм. Прямая фотосенсибилизированная хемилюминесценция синглетного кислорода в растворе ССl4 впервые была зарегистрирована А.А. Красновским. В биологических си­стемах, в том числе и в гепатоцитах, этот метод нужно применять с осторожностью, так как хемилюминесценция не всегда является следствием исключительно только распада синглетного кислорода. Кроме того, в клетке могут присутствовать «тушители» активности 1О2: бета-каротин, гистидин, жирные кислоты.

Для оценки вклада гидроксильного радикала в процессы жиз­недеятельности живых объектов широкое применение имеют раз­личного рода «ловушки» этой частицы: маннитол, бензоат, дерива­ты мочевины и др. Применение в биологических исследованиях соединений, способных специфически удалять из систе­мы те или иные кислородреактивные частицы, является довольно широко распространенным приемом.

Несмотря на интенсивное изучение механизмов перекисьобразования в живых системах, многие аспекты до сих пор остаются открытыми. В настоящее время нет общего теоретического обосно­вания физиологической значимости процесса поэтапного восстановления кислорода и образующихся при этом частиц. В значи­тельной степени это связано с трудностями методического харак­тера. Поэтому идет постоянный поиск новых методов и объектов, позволяющих более глубоко и детально проникать в сущность механизмов образования и метаболизма перекисей. Одной из доста­точно адекватных моделей для изучения такого рода процессов яв­ляется ткань печени и, в частности, суспензия изолированных ге­патоцитов.




© Авторы и рецензенты: редакционный коллектив оздоровительного портала "На здоровье!". Все права защищены.


 
Текст сообщения*
Защита от автоматических сообщений
Загрузить изображение
 

nazdor.ru
На здоровье!
Беременность | Лечение | Энциклопедия | Статьи | Врачи и клиники | Сообщество


О проектеКарта сайта β На здоровье! © 2008—2015
nazdor.ru, nazdor.com
Контакты Наш устав

Рекомендации и мнения, опубликованные на сайте, являются справочными или популярными и предоставляются широкому кругу читателей для обсуждения. Указанная информация не заменяет квалифицированную медицинскую помощь, основанную на истории болезни и результатах диагностики. Обязательно проконсультируйтесь с врачом.

Размещенные на сайте информационные материалы, включая статьи, могут содержать информацию, предназначенную для пользователей старше 18 лет согласно Федеральному закону №436-ФЗ от 29.12.2010 года "О защите детей от информации, причиняющей вред их здоровью и развитию".