Пользовательский поиск

Взаимоотношения систем генерации и утилизации гидроперекисей в гепатоцитах

Вопрос взаимоотношения путей генерации и утилизации гидро­перекисей в клетке в целом до сих пор остается открытым. Одна­ко имеющиеся в литературе данные указывают на их тесную взаи­мосвязь: усиление продукции кислородреактивных частиц приво­дит к активации систем их утилизации. Особый интерес в этом отношении представляют перекись водорода и ферменты ее ката­болизма — каталаза и глутатионпероксидаза. Эти ферменты имеют четкую компартментализацию в клетках пе­чени. Основная часть каталазы локализована в пероксисомах, глу­татионпероксидаза представлена в митохондриях и цитозоле. Логично предположить, что подключение того или иного пути катаболизма Н2О2 должно зависеть от места ее генерации. Действительно, как показано на перфузируемой печени Ошино и соавторами, перекись, образующаяся в пероксисомах в уратоксидазной реакции в присутствии мочевой кислоты, практически пол­ностью распадается в каталазной реакции. Даже в случае 90%-ного ингибирования каталазы триаминотриазолом введение в перфузат урата дает соотношение окисленная мочевая кислота — по­требленный кислород, равное 1,4, что указывает на значительный вклад каталазного пути распада Н2О2. Это полностью согласуется со стехиометрией процесса. Действительно, при окислении двух молей мочевой кислоты образуется 2 моля Н2О2, причем этот процесс сопровождается потреблением двух молей кислорода. Если бы при ингибировании каталазы вся перекись распадалась по глутатионпероксидазному пути, отношение окисленная мочевая кислота — потребленный О2 было бы равно 1, так как в этом слу­чае реакция идет по схеме


2О2 + 4GSH —— 4Н2О + 2GSSG.

Каталазный же путь деградации перекиси сопровождается выде­лением 1 моля О2 на 2 моля Н2О:

2О2 — 2 Н2О + О2.

Таким образом, если вся перекись утилизируется в системе ката­лазы, на 2 моля окисленного урата будет выделяться 1 моль кис­лорода и соотношение будет равно 2. Промежуточное значение (1,4) указывает на участие в катаболизме перекиси водорода обеих ферментных систем. В этом случае подключение ГПО возможно только при наличии выхода Н2О2 из пероксисом в цитозоль. Веро­ятность этого процесса достаточно велика, так как скорость диф­фузии перекиси водорода через клеточные мембраны только незначительно уступает воде и для пероксисомальной мембраны со­ставляет 0,2 см/мин. Прямое доказательство возможности выхода Н2О2 за пределы пероксисом показано в работе Бовериса и соавторов. Ими установлено, что при стимуляции образо­вания перекиси уратом в изолированной фракции этих органелл до 60% ее регистрируется во внепероксисомальном пространстве. При ингибировании каталазы азидом это значение увеличивалось до 90%. Следовательно, при определенных условиях Н2О2, гене­рируемая внутри пероксисом, может стать доступной для ГПО. В этом случае активация работы фермента должна сопровождать­ся усилением скорости окисления GSH и выхода GSSG. Действительно, после 90%-ного ингибирования каталазы 3-аминотриазолом введение в перфузируемую печень урата приводит к заметному увеличению выхода окисленного глутатиона.

Изолированные гепатоциты являются адекватной моделью для изучения кооперативности действия каталазы и глутатионпероксидазы, Действительно, скорость продукции Н2О2 при утилизации, гликолата суспензией гепатоцитов находится в прямой зависимо­сти от концентрации субстрата. Активация глутатионпероксидазного пути распада генерируемой пероксисомами пере­киси в этих условиях наблюдается только при высокой скорости ее образования — более 4 нмоль в мин-1 на 10-6 клеток, что соответствует 400 нмоль в мин-1 на г-1 ткани печени. Если же клетки были выделены из печени животных, предварительно обрабо­танных триаминотриазолом, который на 90% ингибировал каталозу, скорость образования окисленного глутатиона увеличивалась.

Экзогенно вводимая гидроперекись способна утилизироваться клетками печени. Причем в этом случае ее метаболизирование связано в основном с каталазной активностью, что было показа­но Джоунсом на изолированных гепатоцитах. Оценку ак­тивности каталазы проводили по скорости выделения О2 в среде инкубации. Зная, что при выделении 1 моля кислорода утилизируется 2 моля Н2О2, легко рассчитать, сколько перекиси распалось в каталазной реакции. Относительное количество перекиси, катаболизируемой в системе каталазы, увеличивается с увеличением ее концентрации в среде инкубации клеток.

При инфузии перекиси водорода со скоростью 12,8 нмоль/мин/мл (что соответствует максимальной эндогенной скорости генера­ции перекиси гепатоцитами в присутствии 10мМ гликолата) около 30% ее метаболизируется не каталазой. Поскольку при этом отмечается падение уровня восстановленного глутатиона, некаталазный путь утилиза­ции H2O2 связан, по-видимому, с глутатионпероксидазной активностью. Измеренная в этих условиях скорость снижения концен­трации GSH составляла 1,4 нмоль в мин-1 на 10-6 клеток. Следовательно, на каждые 4 нмоля перекиси водорода, утилизируемых в системе глутатион-пероксидазы, концентрация восстановленного глутатиона снижается на 1,4 нмоля. Это соотношение можно ис­пользовать для ориентировочной оценки активности глутатионпероксидазы в гепатоцитах.

Не менее важным, но более сложным для решения в методиче­ском отношении является вопрос о роли каталазы в утилизации перекиси водорода, генерируемой в цитозоле. Так, например, Ошино и соавторы показали, что в присутствии субстрата мик­росомального окисления амидопирина достоверного увеличения образования каталазного комплекса с Н2О2 не наблюдалось. Кро­ме того, в этих условиях имелись минимальные отличия в скоро­сти выделения GSSG по сравнению с контролем. Это свидетельст­вует в пользу того, что роль микросомальной фракции в продукции перекиси водорода интактным органом невелика. Однако в усло­виях индукции микросомальных ферментов фенобарбиталом амидопирин приводит более чем к двухкратному увеличению ско­рости выделения окисленного глутатиона. Ингибирование каталазы триаминотриазолом не приводило к активации глута­тионпероксидазной реакции. Следовательно, в условиях индукции ферментов практически вся перекись, генерируемая микросомаль­ной фракцией, утилизируется через глутатионпероксидазу. Этот вывод справедлив как для интактного органа, так и для изолиро­ванных клеток печени. Действительно, инкубация суспензии гепатоцитов, выделенных из печени крыс, обработанных фенобарбита­лом, в присутствии этилморфина приводит к активации глутатион­пероксидазной реакции. При этом ингибирование каталазы три-аминотриазолом, так же как в целой печени, не интенсифицирует скорость окисления GSH и выделения GSSG.

Расчетная скорость глутатионпероксидазной реакции гепатоци­тов при внутриклеточной концентрации Н2О2, равной 50нМ, со­ставляет около 1 мкмоль в мин-1 на г-1 ткани, в то время как макси­мальная скорость этой реакции, полученная для гомогената пе­чени, равна 40 мкмоль в мин-1 на г-1. Следовательно, в интакт­ной клетке существует ограничение утилизации Н2О2 по этому пути. Поскольку глутатионпероксидазный механизм ее катаболиз­ма тесно сопряжен с восстановлением GSSG в системе глутатион-редуктазы, которая является НАДФН-зависимым фер­ментом, можно предположить, что лимитирующим фактором пероксидазного пути распада перекиси является уровень восстановленности НАДФН в клетке. Это предположение подтверждается тем фактом, что расчетная скорость генерации НАДФН в клетках печени близка к скорости глутатионпероксидазной реакции в гепатоцитах.

Восстановление экзогенно вводимой терт-бутилгидроперекиси (t-BOOH) в перфузируемую печень также идет со скоростью, ко­торая сравнима с интенсивностью генерации НАДФН. Следовательно, эффективность механизмов утилизации перекисей в гепатоците зависит от уровня восстановленности НАДФН. Поэтому механизмы, направленные на поддержание высокой степени восстановленности пула пиридиннуклеотидов, должны способствовать эффективному метаболизму перекисей. Активация пентозофосфатного шунта, увеличение актив­ности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, изоцитратдегидрогеназы, «малик»-фермента, глутаматдегидрогеназы, НАД/НАДФН+-трансгидрогеназы, усиление генера­ции НАДФН соответствующими субстратами — все это может приводить к дополнительному поступлению восстановительных эк­вивалентов к глутатионредуктазе и, следовательно, усилению эффек­тивности действия глутатионпероксидазы. Это положение нагляд­но демонстрируется на эритроцитах, инкубация которых с 0,1мМ t-BOOH в присутствии глюкозы приводит к 9-кратному увеличе­нию активности пентозофосфатного шунта.

Способность некоторых субстратов ЦТК (в особенности сукцината) поддерживать на высоком уровне восстановленность пиридиннуклеотидов при метаболизировании t-BOOH изолированной фракции митохондрий говорит об активном участии этих органелл в обеспечении катаболизма гидроперекисей.

Инкубация изолированных клеток печени в присутствии эндо­генных субстратов с t-BOOH приводит к значительному снижению уровня общей восстановленности пиридиннуклеотидов, обуслов­ленному главным образом окислением НАДФН, так как при этом не отмечается существенного увеличения отношений лактат/пируват и бета-гидроксибутират/оксалоацетат.

Скорость восстановления флуоресценции до исходного уровня, являющаяся показателем эффективности протекания глутатион­пероксидазной реакции, в значительной степени зависит от обеспе­чения субстратами. Так, в присутствии глюкозы и октаноата этот показатель в 2 раза выше сравнительно с эндогенными субстрата­ми (в первом случае, вероятно, за счет стимуляции пентозо­фосфатного шунта, во втором — за счет усиления работы митохондриальной энергозависимой НАД-НАДФ+-трансгидрогеназы).

Таким образом, поддержание равновесной концентрации кис­лородреактивных частиц в клетке обеспечивается кооперативным действием всех систем утилизации и сопряженных процессов.




nazdor.ru
На здоровье!


Пользовательский поиск

Узнайте больше:



Большинство диет для похудения просто крадут ваши деньги


Беременность | Лечение | Энциклопедия | Статьи | Врачи и клиники | Сообщество


О проекте Карта сайта β На здоровье! © 2008—2017 
nazdor.ru, nazdor.com
Контакты Наш устав

Рекомендации и мнения, опубликованные на сайте, являются справочными или популярными и предоставляются широкому кругу читателей для обсуждения. Указанная информация не заменяет квалифицированную медицинскую помощь, основанную на истории болезни и результатах диагностики. Обязательно проконсультируйтесь с врачом.

Размещенные на сайте информационные материалы, включая статьи, могут содержать информацию, предназначенную для пользователей старше 18 лет согласно Федеральному закону №436-ФЗ от 29.12.2010 года "О защите детей от информации, причиняющей вред их здоровью и развитию".