Равновесная концентрация кислородреактивных частиц, представляющих определенную опасность для жизнедеятельности клетки, поддерживается на очень низком уровне и составляет 10-9 – 10-7М для Н2О2 и 10-12 –10-11М для О2. Достигается это в результате работы группы ферментов, к числу которых относятся супероксиддисмутаза (СОД), каталаза (Кат) и глутатионпероксидаза (ГПО).
В клетках эукариот супероксиддисмутаза представлена двумя формами: медь- и цинксодержащей СОД и марганецсодержащей СОД. Первая локализована в цитозоле и межмембранном пространстве митохондрий, вторая обнаружена в матриксе митохондрий. Оценить вклад той или иной формы СОД в процессе дисмутации супероксида можно на основании различия их свойств: Си/Zn-СОД ингибируется цианидом, но не теряет активности после обработки хлороформэтанольной смесью, в то время как Мn-СОД денатурируется после такого воздействия, однако резистентна к воздействию цианида.
Каталаза присутствует практически во всех клетках млекопитающих и локализована главным образом в пероксисомах. Содержание ее в перфузируемой печени составляет 13±1 нмоль на г-1 ткани. В изолированных гепатоцитах оно несколько выше и равно 22±1 нмоль на г-1 печени.
Отличительным свойством каталазы является способность разлагать перекиси по двум путям различного типа — каталазному и пероксидазному. В обоих случаях процесс идет через образование промежуточного фермент-субстратного комплекса (комплекс 1): kl
Кат — Fe3+ + H2O2 —— комплекс 1,
Комплекс 1 + H2O2 —— Кат — Fe+3 + 2Н2О + О2,
Комплекс 1 + АН2 —— Кат — Fe+3 + 2Н2О + А.
В первом случае разложение двух молей перекиси водорода идет с образованием воды и триплетного кислорода (каталазный путь). Во втором – одна молекула Н2О2 необходима для окисления донора водорода (АН2), к числу которых относятся этанол, метанол, формат и др. (пероксидазный путь). Специфичность каталазы в отношении перекисей довольно высока. Помимо Н2О2, она способна разлагать с достаточно высокой скоростью только метил- и этилгидроперекись. В отличие от них терт-бутилгидроперекись не является субстратом для каталазы.
К ингибиторам фермента относятся азид натрия и цианиды. Во втором случае характер ингибирования зависит от концентрации перекиси водорода. При низких концентрациях процесс идет по типу неконкурентного, при высоких — приобретает конкурентную зависимость.
К специфическим ингибиторам каталазы относится гербицид — 3-амино-1,2,4-триазол(АТ). Связываясь с белковой частью молекулы фермента, АТ приводит к подавлению активности каталазы. Причем ингибирующее действие проявляется только при непрерывном поступлении Н2О2 к образующемуся фермент-ингибиторному комплексу (каталаза — АТ):
H2O2 + кат = комплекс 1,
Комплекс 1+ АТ = кат — АТ (необратимое подавление).
Подавления каталазной активности не происходит при введении аминотриазола вместе с этиловым спиртом. В этом случае защитный эффект объясняется участием этанола в разрушении комплекса 1.
Глутатионпероксидаза катализирует реакции разложения перекисей более широкого спектра, чем каталаза. Помимо Н2О2, она способна восстанавливать гидроперекиси жирных кислот, а также перекиси белкового или нуклеинового происхождения. Кумен- и терт-бутилгидроперекиси легко утилизируются в системе ГПО.
Процесс разложения перекисей глутатионпероксидазой идет с привлечением восстановленного глутатиона (GSH) в качестве донора водорода:
ROOH + 2GSH — RОН + GSSG + Н2О.
Фермент специфичен в отношении GSH. Активность глутатионпероксидазного пути разложения гидроперекисей в сильной степени зависит от концентрации донора водорода в клетке. Достаточный уровень GSH поддерживается в клетках печени как синтезом de novo, так и восстановлением окисленного глутатиона в сопряженной системе НАДФН — глутатион-редуктазы (ГР) (около 8-10 мкмоль в мин-1 на г-1 ткани).
Восстановление НАДФН, который необходим для эффективной работы глутатионредуктазы, происходит в различных метаболических путях, но главным образом в пентозо-фосфатном цикле.
Основная масса глутатионпероксидазы локализована в цитоплазме — 70%, остальные 30% приходятся на долю матрикса митохондрий. Специфических ингибиторов этого фермента не найдено, однако известно, что йод и хлорацетат необратимо его алкилируют, что приводит к потере активности энзима.
Помимо глутатионпероксидазы в клетках печени имеется целый класс ферментов — глутатион-Э-трансфераз, которые способны разлагать гидроперекиси органического происхождения (но не H2O2). На долю этих ферментов приходится до 10% всех белков клеток печени.
Предохранение клеток от вредоносного воздействия продуктов неполного восстановления кислорода может осуществляться не только за счет удаления уже образовавшихся частиц, но и путем ограничения процессов их генерации. Так, например, цитотоксический эффект многих хинонов является следствием одноэлектронного их восстановления до семихиноновых радикалов в системе микросом. Вступая в редокс-цикл с молекулярным кислородом, эти радикалы продуцируют активные кислородные частицы. Однако, как показано на суспензии изолированных гепатоцитов, помимо одноэлектронного, возможен двухэлектронный процесс восстановления хинонов до диолов с последующим удалением их из клетки. Осуществляется этот процесс ферментом ДТ-диафоразой (НАД(Ф)Н: (хинон — акцептор/оксидоредуктаза) .
К неэнзиматическим механизмам защиты клеток от реактивных интермедиатов кислорода можно отнести специфические вещества-перехватчики, обнаруженные в клетке. Так, p-каротин, витамин Е, гистидин могут «тушить» синглетный кислород. Эндогенно образующиеся этанол, метанол, муравьиная кислота являются «ловушками» гидроксильного радикала. В некотором смысле перекисное окисление липидов также можно отнести к неферментативным средствам защиты против «оксидативного» стресса, поскольку липиды, перехватывая на себя активный кислород, являются как бы демпфером, предохраняя от его воздействия другие, жизненно более важные молекулы. Кроме того, известно, что насыщенные жирные кислоты могут «тушить» О2 через физический механизм, диссипируя его энергию по длине своей цепи.
