Несмотря на то что в процессе биотрансформации веществ в конечном итоге образуются менее токсичные соединения, многие промежуточные продукты I и II стадии могут обладать высоким гепатотоксическим эффектом. На I стадии биотрансформации ксенобиотиков большую опасность представляет образование реактивных продуктов восстановления кислорода, связанное в основном с пероксидазной активностью цитохрома Р-450. Их источником может быть дисмутация супероксидного аниона, высвобождаемого при диссоциации оксицитохрома Р-450, что приводит к образованию Н2О2 и органических гидроперекисей. Образование Н2О2 в изолированных гепатоцитах в условиях N-деметилирования различных веществ, в том числе этилморфина, показано экспериментально. Оно протекает в условиях резкого истощения внутриклеточного пула GSH и увеличения оттока из клетки GSSG, что ведет к истощению общего внутриклеточного пула глутатиона, так как нарушается цикл глутатионпероксидазной реакции восстановления GSSG в GSH. Это увеличение выделения GSSG сравнительно с нормой может быть связано с непосредственным взаимодействием метаболитов ксенобиотиков с GSH, так как оно не наблюдается в аноксических условиях.
Образование перекиси водорода происходит и во время активности НАДФН- и НАДН-редуктазы.
Высокие концентрации Н2О2 и органических гидроперекисей (например, t-бутилгидроперекиси) обладают сильным цитотоксическим эффектом, выражающимся в нарушении поверхностной структуры клетки, деградации GSH и выходе Са2+ из гепатоцита во внеклеточное пространство. Последнее может быть наиболее значимым для клетки, так как приводит к нарушению внутриклеточного кальциевого гомеостаза и ингибированию ферментов, участвующих в формировании цитоскелета гепатоцита, например АТФазы актомиозина.
Реактивные радикалы кислорода могут образовываться в окислительно-восстановительных превращениях путем непосредственного взаимодействия ксенобиотиков, имеющих хиноновую структуру, с кислородом. Примерами являются вещества «адрианомицин» и «даунорибицин», а также «гербицид паракат».
Взаимодействие свободнорадикальных продуктов восстановления кислорода с ненасыщенными алкильными цепями приводит к инициации перекисного окисления липидов биологических мембран.
Главный токсический эффект продуктов перекисного окисления в целом заключается в изменении микроархитектуры мембранных образований, приводящей к нарушению их проницаемости, подавлению ферментативной активности и образованию токсичных продуктов типа альдегидов.
Наряду с этим ряд субстратов как первой, так и второй стадий биотрансформации могут образовывать высокотоксичные промежуточные продукты, не связанные с радикальными процессами. Уже не раз была замечена способность дигидродиолов — метаболитов эпоксидгидролазной реакции — вновь метаболизироваться в цитохром Р-450-зависимой реакции и при этом рециклироваться до дигидродиолэпоксидов, гораздо более токсичных, чем исходные вещества. Образование дигидродиолэпоксидов возможно также и из ароматических углеводородов. Высокой токсичностью обладают глюкурониды некоторых карциногенных ариламинов. Для реакций сульфатации известен пример образования исключительно токсичного конъюгата — гидрокси-2-ацетиламинофлуорена. Выраженной токсичностью обладает продукт ацетилирования арилгидроксамовой кислоты — N-ацилоксиариламин.
С помощью гепатоцитов, которые сохраняют способность к реализации самых разнообразных этапов биотрансформации веществ, можно изучать не только вклад различных реакций в этот процесс и их взаимодействие, но и механизм цитотоксического эффекта. Примером может служить вещество «парацетамол». Механизм его действия, расшифрованный на изолированных гепатоцитах, связан с нарушением целостности плазматической мембраны в результате образования токсических продуктов в реакции конъюгации, глюкуронидации и сульфатации, а также в результате истощения внутриклеточного пула GSH в реакциях конъюгации с ним.
Результат токсичности очень часто может зависеть от дисбаланса между скоростью образования токсичных продуктов и их инактивации в соответствующей реакции, например конъюгации с глутатионом, наиболее важным защитным механизмом клетки при биотрансформации веществ.
Глутатион — это нейтрофильное соединение, характеризующееся реактивной тиоловой группой. Большая часть внутриклеточного глутатиона находится в виде восстановленной формы (GSH). Наряду с этим в клетке имеются еще смесь дисульфидов, связанных главным образом с белками (GSS-белок), тиоэфиры и очень небольшое количество окисленного глутатиона (GSSG). Синтез глутатиона катализируется рядом ферментов из нативных белков. За его деградацию ответствен фермент глутамилтрансфераза.
GSH играет центральную роль в инактивации токсичных и реактивных продуктов, генерируемых в реакциях биотрансформации. Известна защитная роль глутатиона от реактивных продуктов свободнорадикальных процессов и перекисного окисления липидов.
Механизм его детоксицирующего действия при биотрансформации веществ, связанного с образованием конъюгатов, по-видимому, заключается в нейтрофильной атаке электрофильных атомов (углерода, азота, серы).
В нормальных условиях содержание GSH в гепатоцитах очень велико. Оно равно 0,5-10мМ, т.е. в среднем достигает значений, показанных для печени. В изолированных гепатоцитах сохраняется высокая скорость его оборота. Период его полужизни сходен с интактной тканью. Однако ситуация катастрофически меняется в патологических условиях, когда скорость образования электрофильных метаболитов и потребность в GSH в связи с активацией процесса конъюгации может существенно превысить способность клеток печени к ресинтезу глутатиона. В результате будут происходить истощение пула GSH, аккумуляция токсических метаболитов и гибель клетки. Подобные ситуации описаны для гепатоцитов в связи с биотрансформацией целого ряда ксенобиотиков, например бензоата, диэтилмалеата и парацетамола. При этом вместо конъюгации ксенобиотиков с глутатионом происходят алкилирование макромолекул в клетке, потеря GSH и других низкомолекулярных нуклеофилов, активация перекисного окисления липидов, нарушение нормальных функций клеток печени. Таким образом, очевидно, что уровень внутриклеточного GSH является лимитирующим звеном всего процесса. Поэтому проблема его восстановления и сохранения в гепатоците чрезвычайно важна для его жизнедеятельности.
Для биосинтеза глутатиона нужны глутамат, глицин, сульфоаминокислота типа метионина или цистеина. Однако концентрация цистеина в клетке очень мала (всего 2% от содержания GSH) . Кроме того, благодаря высокой реактивности тиоловых групп цистеин легко окисляется в аэробной среде до соответствующих дисульфидов. Поэтому его внутриклеточный уровень, видимо, лимитирует биосинтез глутатиона в печени. Для поддержания последнего в инкубационную среду вводят N-ацетилцистеин или метионин (предшественники цистеина), которые в отличие от последнего легко проникают в клетку, плохо поглощают дисульфиды и могут конвергировать в GSH в цистотионатной реакции.
