Метаболизм этанола в печени является наглядным примером существования сложного и тонко отрегулированного взаимодействия полиферментных систем различных компартментов органелл клетки в биотрансформации веществ. Благодаря исследованиям в последние 15 лет установлено, что этанол, введенный в организм в низких концентрациях (до 2мМ) быстро метаболизируется в печени; 75-95% его окисляется в паренхиматозных клетках. Основной путь его деградации связан с алкогольдегидрогеназой (АДГ) — ферментом, находящимся в растворимой части цитозоля и ответственным за конверсию этанола в ацетальдегид в присутствии НАД+. Ацетальдегид окисляется до ацетата альдегиддегидрогеназой, локализованной в митохондриальном компартменте.
Благодаря этому контроль за окислением этанола осуществляется, во-первых, активностью АДГ; во-вторых, транслокацией восстановительных эквивалентов из цитозоля в митохондрии; в-третьих, окислением в митохондриях восстановительных эквивалентов кислородом. В зависимости от экспериментальных условий каждый фактор может быть лимитирующим для метаболизма этанола.
В нормальных условиях дальнейший метаболизм ацетальдегида в митохондриях происходит очень быстро, со скоростью 10 нмоль в мин-1 на мг-1 белка, и лимитирующим звеном всей реакции в целом является окисление этанола до ацетальдегида, которое зависит от диссоциации комплекса фермент — НАДН. В интактной печени эта диссоциация регулируется уровнем цитозольного НАД+, который лимитирует скорость всего процесса метаболизма этанола. Его реокисление связано с работой шунтов, обеспечивающих перенос восстановительных эквивалентов в митохондриальный компартмент. Согласно мнению большинства исследователей, основная роль в этом процессе при окислении этанола отводится малат-аспартатному и альфа-глицерофосфатному шунтам. Максимальная скорость окисления этанола в изолированных гепатоцитах обеспечивается высокой концентрацией интермедиатов шунтов, в том числе глутамата, аспартата и глицерол-3-фосфата. Увеличение их концентрации в гепатоцитах повышает соответственно метаболический поток через каждый шунт. В обычных условиях мощность обоих шунтов в гепатоцитах крыс примерно одинакова.
Потеря глутамата и аспартата при выделении гепатоцитов может сказываться на активности малат-аспартатного шунта, снижая ее. Возможно, именно этим объясняется отрицательный вывод Берри и Куна о роли малат-аспартатного шунта в метаболизме этанола. Однако в процессе инкубации происходят медленная регенерация интермедиатов шунта и относительное восстановление его активности. Различия в концентрации интермедиатов шунтов у сытых и голодных животных определяют особенности метаболизма этанола в этих двух состояниях (скорость окисления этанола у сытых в 1,5 раза больше, чем у голодных). Благодаря ограниченной транспортной способности шунтов отношение НАДН/НАД+ в цитозоле резко увеличивается во время метаболизма этанола, а именно это перевосстановление, возможно, ответственно за эффекты, связанные с длительным введением алкоголя в организм.
Дополнительно к АДГ существуют по крайней мере еще две системы, которые участвуют в окислении этанола. В присутствии перекиси водорода, как известно, каталаза катализирует окисление как метанола, так и этанола до соответствующих альдегидов.
Так как Н2О2 является естественным продуктом, образующимся в нормальных физиологических условиях в различных метаболических путях в клетке, включая бета-окисление жирных кислот, а также аутооксидацию цитохрома Р-450, окисление этанола в гепатоцитах может происходить за счет активации пероксидазной функции каталазы. Этот зависимый от каталазы путь окисления этанола является дополнительным к основному, АДГ-зависимому. Действие этого механизма наглядно демонстрируется на гепатоцитах в присутствии высоких концентраций аминооксиацетата, который в этом случае не выполняет функцию ингибитора аминотрансфераз, а активно метаболизируется в гликолат. Последний, являясь субстратом пероксисом, генерирует Н2О2, которая стимулирует окисление этанола как в каталазной реакции, так и за счет окисления цитоплазматического НАД в глиоксилатной реакции, что приводит к вторичной активации АДГ. Таким образом, в присутствии гликолата или высоких концентраций аминооксиацетата наблюдается стимуляция окисления этанола. Поэтому, хотя участие каталазы в метаболизме этанола в обычных условиях невелико, ее роль может резко усилиться при увеличении генерации перекиси водорода в клетке.
На протяжении более чем 15 лет дискутируется возможность участия в метаболизме этанола так называемой микросомальной этанолокисляющей системы (МЭОС), которая является НАДФН- и цитохром Р-450-зависимой.
Ее функция не связана с пероксидазной активностью каталазы, как это считалось одно время. Есть мнение, что существует специальная форма цитохрома Р-450, которая активируется при окислении этанола. Вполне возможно, что эта реакция медиируется гидроксильным радикалом (ОН), генерируемым системой цитохрома Р-450, как это было показано Цедербаумом и другими. Окончательного решения этого вопроса на сегодняшний день пока еще нет.
Наряду с этим имеется экспериментально подтверждаемая гипотеза, что в последней реакции органические гидроперекиси могут замещать НАДФН и также поддерживать окисление этанола, длинноцепочечных и вторичных спиртов. Этот механизм не связан с инициацией гидроксильных радикалов и не чувствителен к его скэвенджерам, так же как и к ингибиторам НАДФН-зависимого окисления. В связи с этим предполагается, что в зависимости от используемого механизма (НАДФН-зависимой системы или органических гидроперекисей) в реакции могут участвовать различные изоэнзимы цитохрома Р-450.
Действие этанола на редокс-состояние клетки, с одной стороны, и участие НАДФН-зависимой ферментной системы в его окислении — с другой, предопределяет возможность взаимовлияния метаболизма этанола и ксенобиотиков. Как правило, оно выражается в ингибирующем действии этанола на различные реакции биотрансформации других веществ. Эти взаимодействия интенсивно изучаются на гепатоцитарной модели.
Уменьшение отношения НАД+/НАДН, возникающее при метаболизме этанола в реакции, катализируемой АДГ, влияет на общий редокс-потенциал клетки, в результате чего могут произойти ингибирование цикла Кребса и бета-окисления жирных кислот, а также последующее опосредованное уменьшение транспорта восстановительных эквивалентов из митохондрий в цитозоль, что в конечном счете будет отрицательно сказываться на работе НАДФН-зависимых систем окисления гепатоцита. Увеличение митохондриального НАДН может непрямым образом так же влиять на скорость генерации НАДФН в пентозо-фосфатном цикле.
Известны примеры отрицательного действия метаболизма этанола на различные реакции II стадии биотрансформации веществ, в том числе глюкуронидацию. В то же время этанол активирует реакции ацетилирования сульфаниламида (но не прокаинамида) в гепатоцитах, благодаря тому что он увеличивает концентрацию ацетил-КоА в цитозоле, необходимого для этого процесса.
Вторая стадия биотрансформации веществ в изолированных гепатоцитах
Метаболиты, образованные во время I стадии биотрансформации, могут подвергаться дальнейшим превращениям с помощью целого ряда реакций II стадии. Как правило, при этом образуются более полярные и менее токсичные соединения, которые достаточно легко выводятся из клетки. Однако часть липофильных ксенобиотиков является субстратами исключительно только этой стадии и метаболизируются, минуя I стадию. Известны пять основных типов реакций, относящихся ко II стадии биотрансформации, причем часть из них являются энергозависимыми.
Жизнеспособные гепатоциты интенсивно используются для изучения всех реакций II стадии биотрансформации ксенобиотиков.
Глюкуронидация
Конъюгация веществ с глюкуроновой кислотой широко распространена при биотрансформации веществ. Субстратами реакций являются как продукты I стадии, так и вещества, метаболизирующиеся только с помощью этой реакции (различные спирты, карбоновые кислоты, ряд эндогенных субстратов, как, например, билирубин и стероидные гормоны). Продукты этой реакции являются полярными соединениями и поэтому легко выводятся из клетки. Они, как правило, менее токсичны, нежели исходные неконъюгированные продукты I стадии. Исключение составляют бета-глюкурониды некоторых канцерогенных ариламинов. Образование конъюгатов катализируется ферментом глюкуринилтрансферазой, который обеспечивает превращения УДФ-альфа-D-глюкуроновой кислоты до бета-D-глюкуронида. В гепатоцитах, в которых глюкуронилтрансферазная активность существенно выше, чем в других клетках, фермент локализован в эндоплазматическом ретикулуме и оболочке ядра. Скорость глюкуронидации в изолированных гепатоцитах сравнима со скоростью этого процесса в микросомах. Реакция индуцируется как фенобарбиталом, так и 3-метилхолантреном и ингибируется салициламидом. Индуктором этого фермента являются глюкокортикоиды, а УДФ-N-ацетилглюкозамин постулируется в качестве возможного регулятора трансферазной активности в гепатоците.
Активность УДФ-глюкуронилтрансферазы зависит от генерации кофакторов в различных субклеточных компартментах. УДФ-глюкуроновая кислота образуется из УТФ и глюкозы в последовательной цепи реакций, одна из которых является НАД+-зависимой. Поэтому увеличение отношения НАДН/НАД+ в цитозоле инициирует эту реакцию и может уменьшать синтез УДФ-глюкуроновой кислоты. Этот механизм был постулирован, чтобы объяснить снижение образования глюкуронидов в изолированных гепатоцитах под влиянием этанола.
Конъюгация чужеродных соединений с глутатионом
Конъюгация чужеродных соединений с глутатионом в гепатоцитах используется чрезвычайно широко. Процесс катализируется группой мультиферментов — глутатион-S-трансфераз, обладающих широкой субстратной специфичностью. Они участвуют также в связывании гидрофобных соединений и играют большую роль в поддержании глутатионпероксидазной активности. В гепатоцитах глутатион-S-трансферазы найдены в эндоплазматическом ретикулуме, митохондриях и оболочке ядра. Их концентрация в цитозоле очень высока и в некоторых состояниях может составлять до 10% от содержания общих растворимых белков печени крысы. На глутатион-S-трансферазную активность сильно влияет гормональный статус животного, некоторые индукторы ферментов, включая фенобарбитал и полициклические углеводороды, а также антиоксиданты.
Глутатион-S-конъюгаты — полярные соединения, легко экскретируемые из клетки. Однако перед этим большинство из них метаболизируются до соответствующих меркаптанов с промежуточным образованием цистеинилглицина, цистеина и N-ацетилцистеин-S-конъюгатов. Гепатоциты широко используются для изучения этого процесса. На сегодняшний день хорошо изучен метаболизм анальгетика парацетамола, биотрансформация которого в клетках печени приводит к образованию тиоловых конъюгатов глюкуроновой кислоты в качестве основных метаболитов. Однако в результате взаимодействия парацетамола с системой цитохрома Р-450 могут образовываться также электрофильные метаболиты, которые инактивируются затем в реакциях конъюгации с GSH. Образование тиоловых конъюгатов в изолированных клетках печени используется в качестве меры интенсивности метаболизма парацетамола системой цитохрома Р-450. В гепатоцитах, полученных от животных, индуцированных фенобарбиталом и 3- метилхолантреном, утилизация GSH во время метаболизма парацетамола является показателем их способности к его ресинтезу.
Сульфатация
Для большинства ксенобиотиков глюкоронидация и сульфатация являются альтернативными процессами. Это хорошо показано на изолированных гепатоцитах. В процессе биотрансформации очень многие ксенобиотики (экзогенные и эндогенные липофильные фенолы, спирты, гидроксиламины, большинство стероидов) образуют сульфатконъюгированные эфиры. Сульфатконъюгаты, как правило, менее реактивны и токсичны, чем их предшественники, хотя имеются исключения, как, например, ацетиламинофлоурен. Реакция катализируется разными сульфаттрансферазами, которые представляют собой мембраносвязанные белки и компартментализованы в цитозоле. Как правило, они неиндуцибельны, но на их активность влияют функциональное состояние животного, пол, возраст, гормональный статус.
Активированная форма сульфатконъюгата 3-фосфоаденозин-5-фосфосульфат (PAPS) является кофактором сульфаттрансферазных реакций и образуется из АТФ, неорганического фосфата и неорганического сульфата. Она используется также в качестве донора в различных биосинтетических путях, катализируемых мембраносвязанными ферментами, как, например, при образовании сульфатированных гликопротеидов и полисахаридов. Реакция сульфатации полностью сохраняется в изолированных гепатоцитах. Так же как и в изолированной перфузируемой печени, она лимитируется неорганическим сульфатом и поэтому может быть усилена его добавлением в инкубационную среду. Сульфат может быть заменен цистеином, который конвертирует в неорганический сульфат в реакции, инициированной цистенноксигеназой.
N-ацетилирование ксенобиотиков представляет собой процесс конъюгации веществ с активной формой ацетила. Эта реакция представляет особый фармакологический и токсикологический интерес, так как существует чрезвычайно широкая индивидуальная вариабельность в скорости ацетилирования веществ у человека и некоторых видов животных. Она связана с генетически обусловленным полиморфизмом ацетил-КоА-зависимой ацетилтрансферазы, локализованной в цитозоле гепатоцитов. Фермент катализирует ацетилирование ариламинов и гидразинов до аминов. С помощью ацетилирования, минуя I стадию биотрансформации, метаболизируется также большинство сульфаниламидов и n-аминобензойная кислота. Эта реакция специфична для паренхиматозных клеток печени. Для реакции необходима ацетилированная форма коэнзима, который регенерирует в цитозоле из цитрата под влиянием фермента цитратлиазы в АТФ-зависимой реакции. Механизмы реакций ацетилирования полностью сохраняются в изолированных гепатоцитах.
Регуляторами процесса в интактных клетках могут быть предшественники ацетил-КоА, влияющие на его ресинтез в цитозоле, и связанный с ним перенос цитрата через митохондриальную мембрану, а также степень энергизации клетки. Снижение энергетического пула клетки приводит к подавлению этой реакции. Скорость ацетилирования при истощении пула АТФ в гепатоцитах снижается в 5 раз и составляет всего 18% от максимальных значений. Скорость же образования n-аминофенола из анилина в аналогичной ситуации уменьшается всего на 25%. Частичная зависимость последней реакции от концентрации АТФ может быть объяснена тем, что некоторая часть анилина (20-30%) после его трансформации до n-аминофенола в цитохром Р-450-зависимой реакции может также подвергаться ацетилированию.
Ацетилирование стрептоцида в гепатоцитах, как и следовало ожидать, не зависит от содержания цитохрома Р-450 и остается линейным в течение 1,5-2ч инкубации в отличие от анилина, скорость превращения которого во времени протекает параллельно уменьшению содержания цитохрома Р-450 в гепатоцитах.
Наконец, следует упомянуть еще об эпоксидгидролазной реакции. Микросомальная эпоксидгидролаза была обнаружена сравнительно недавно. Она катализирует трансформацию электрофильных эпоксидов до соответствующих дигидродиолов путем нуклеофильной атаки перекисью водорода или гидроксильным радикалом молекулы вещества на противоположной эпоксидному кольцу стороне. Прямым продуктом этой реакции также являются менее токсичные и реактивные соединения. Однако ситуация осложняется тем, что образованные дигидродиолы могут снова поступать в цитохром Р-450-зависимую реакцию и образовывать дигидродиоловые эпоксиды, значительно более токсичные, чем исходные вещества. В гепатоцитах эпоксидгидролазная реакция показана, например, при метаболизме бензо-альфа-пирена.
Следует отметить, что частным случаем биотрансформации веществ является одновременное включение различных реакций их превращений. Так, например, метаболические превращения бензо-альфа-пирена в гепатоцитах начинаются с НАДФН-цитохром Р-450-редуктазной реакции, а образующиеся промежуточные продукты служат субстратами реакций глюкуронидации, сульфатации, образуют эпоксиды, дигидродиолы. Часть этих веществ может снова метаболизироваться в системе цитохрома Р-450.
Другим примером является парацетамол. Его биотрансформация в гепатоцитах приводит к образованию сульфатконъюгатов и конъюгатов глюкуроновой кислоты в качестве основных метаболитов. Однако в результате взаимодействия парацетамола с цитохром Р-450-зависимой системой образуются и электрофильные метаболиты, идентичные иминохинону, которые инактивируются конъюгацией с GSH.
