Активность различных реакций системы оксигеназ смешанной функции в изолированных гепатоцитах поддерживается за счет эндогенных факторов на высоком уровне и очень близка к тому, что получено для изолированных микросом в присутствии НАДФН-генерирующей системы. При этом уровень цитоплазматических кофакторов может лимитировать метаболизм ксенобиотиков.
Экспериментально показано, что главным лимитирующим фактором монооксигеназных реакций является их обеспечение восстановительными эквивалентами.
Основным донором электронов для системы микросомального окисления является НАДФН. Синти с соавторами продемонстрировали, что экзогенный НАДФН может повышать скорость деметилирования амидопирина в гепатоцитах в 18 раз, а этилморфина — в 28 раз. Эффективность НАДН в этом процессе составляла 50% от НАДФН. Спектрофотометрические измерения степени восстановленности пиридиннуклеотидов в перфузируемой печени и определение образующихся метаболитов также свидетельствуют о том, что при добавлении субстратов реакций гидроксилирования окисляется НАДФН цитозоля, но не НАДН. Цитозольный НАДФН взаимодействует с редуктазной, флавопротеиновой частью монооксигеназной редокс-цепи, сродство которой к этому коферменту очень велико. Однако НАДФ+ является сильным конкурентным ингибитором этой реакции и активность последней зависит от отношения НАДФН/НАДФ+.
Клетка имеет свои эндогенные резервы цитозольного НАДФН и источники его образования. Показано, что количества НАДФН, непрерывно образующегося за счет эндогенных субстратов, достаточно для длительного метаболизирования с постоянной (но не максимальной) скоростью субстратов микросомального окисления в гепатоцитах, т.е. для работы системы микросомального окисления с невысокой скоростью в стационарном режиме. Однако максимально возможная скорость достигается только в присутствии экзогенного НАДФН.
Поставщиком эндогенного НАДФН во внемитохондриальное пространство гепатоцитов для монооксигеназных процессов могут служить четыре реакции: изоцитратдегидрогеназная, малик-энзимная, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназная и 6-фосфоглюконатдегидрогеназная. Активность первой составляет 65-75% от общей активности указанных реакций. Наименьший вклад дает малик-энзимная реакция (2-4%). Две дегидрогеназы пентозо-фосфатного шунта являются резервными, так как они обычно блокированы высоким отношением НАДФН/НАДФ+ цитозоля. Однако, как только последнее уменьшается, происходят деингибирование этих двух ферментов и увеличение их роли в генерации НАДФН. Таким образом, участие четырех дегидрогеназ в обеспечении монооксигеназных реакций кофактором зависит от скорости утилизации НАДФН и редокс-потенциала НАДФН. При низких скоростях процесса изоцитратдегидрогеназа является главным поставщиком НАДФН для монооксигеназных реакций, а прн высоких — резко увеличивается значимость дегидрогеназ пентозо-фосфатного шунта. В изолированных гепатоцитах максимальная скорость образования НАДФН в реакциях пентозо-фосфатного шунта превышает максимальную скорость утилизации НАДФН при биотрансформации веществ.
Активация того или иного источника восстановительных эквивалентов зависит от функционального состояния клетки, определяющего направление метаболических потоков. Существуют принципиальные различия в обеспечении восстановительными эквивалентами окислительно-восстановительных реакций у животных, обладающих различными запасами гликогена в клетках печени. У сытых животных гепатоцит характеризуется высоким содержанием гликогена и глюкозо-6-фосфата. Активность пентозо-фосфатного шунта и его роль в поддержании реакций гидроксилирования, требующих НАДФН, увеличена. Голодание в течение 18-24ч истощает запасы гликогена, снижая их до 10% от количества в печени сытых крыс. При этом содержание глюкозо-6-фосфата в клетке также падает и генерация восстановительных эквивалентов становится преимущественно митохондриальной. Связь трикарбоновых кислот изоцитрата и цитрата и дикарбоновой кислоты альфа-кетоглутарата с микросомальной цитохром Р-450-зависимой монооксигеназной системой через НАДФН-зависимую изоцитратдегидрогеназную реакцию доказана в многочисленных опытах. Действительно, при инкубации с амидопирином гепатоцитов, полученных из печени сытых животных, наблюдали уменьшение концентрации цитрата и соответствующее увеличение концентрации альфа-кетоглутарата как в митохондриальном, так и в цитозольном компартментах.
Так как ингибиторы трансаминаз — аминооксиацетат и циклосерин — подавляли скорость N-деметилирования аминопирина в гепатоцитах голодных, но не сытых животных, был сделан вывод, что трансаминирование необходимо для быстрого переноса назад в митохондрии альфа-кетоглутарата, что может быть реализовано за счет глутамат-аспартатного обмена.
В клетке существует конкуренция за НАДФН между монооксигеназными реакциями и другими НАДФН-потребляющими процессами (глюконеогенезом, синтезом жирных кислот). Эта конкуренция в присутствии высоких концентраций субстратов микросомального окисления заканчивается подавлением либо глюконеогенеза, либо синтеза жирных кислот в пользу монооксигеназных реакций и предполагает тесную кооперацию между метаболическими путями цитозоля, ответственными за образование НАДФН в клетке. Таким образом, отношение НАДФН/НАДФ+ цитозоля регулирует активность различных метаболических путей, являясь связующим звеном между ними.
Зависимость монооксигеназных процессов от обеспечения их НАДФН особенно заметно проявляется в условиях активации этих процессов, наблюдаемой у животных с индуцированной фенобарбиталом системой микросомального окисления.
Белинским и соавторами показано, например, что у обычных животных при голодании скорость микросомального окисления существенно не изменяется по сравнению с сытыми животными, а у крыс, индуцированных фенобарбиталом, голодание приводит, как правило, к снижению интенсивности процессов микросомального окисления. При этом установлена прямая корреляция между скоростью процесса и внутриклеточной концентрацией НАДФН, но не количеством цитохрома Р-450. Более того, у сытых, но подвергнутых предварительному голоданию крыс, когда скорости окисления чужеродных соединений в системе микросомального окисления были наиболее высокими, концентрация цитохрома Р-450 оставалась сниженной. Увеличение количества микросомальных ферментов в постнатальном развитии также не всегда коррелирует с активностью метаболизма ксенобиотиков. Она зависит прежде всего от обеспечения восстановительными эквивалентами и может лимитироваться ими. Все это еще раз подтверждает, что микросомальное окисление, по-видимому, регулируется наличием кофактора, снабжение которым частично определяется резервом углеводов.
Белинский и соавторы показали, что, по-видимому, митохондрии могут быть поставщиком восстановительных эквивалентов для реакций микросомального окисления не только у голодных, т.е. истощенных по гликогену, но и у сытых животных. Это тем более вероятно, что основная часть (80%) внутриклеточного НАДФН в печени представлена митохондриальным пулом и только 20% — цитозольным. Это заключение подтверждается наблюдением, что этанол — ингибитор цикла трикарбоновых кислот — на 60-80% подавляет О-деметилирование n-нитроанизола в печени как сытых, так и голодных индуцированных фенобарбиталом крыс.
Дополнительным свидетельством тому, что у сытых животных имеет место взаимосвязь митохондриальных и микросомальных процессов, служит показанное Сиссом и Вейглом снижение концентрации цитрата и увеличение концентрации альфа-кетоглутарата в присутствии 1мМ амидопирина как в митохондриях, так и в цитозоле, причем в последнем в большей степени. Отношение цитрат/альфа-кетоглутарат может быть использовано для определения величины НАДФН/НАДФ+. В присутствии амидопирина это отношение снижается до 44% от контрольной величины в цитозоле и до 57% в митохондриях. Таким образом, митохондриальный НАДФН остается все-таки более восстановленным, чем цитозольный. Поддержание высокой концентрации восстановленного НАДФН в митохондриях осуществляется через энергозависимую трансгидрогеназную реакцию. Благодаря ей в условиях высокой степени энергизации НАДФ в клетке всегда больше восстановлен, чем НАД.
Таким образом, для реализации реакций микросомального окисления необходимы восстановительные эквиваленты в виде внемитохондриального НАДФН, который при определенных условиях может быть лимитирующим фактором процесса. НАДФН в клетке образуется не только в цитозоле, но и в митохондриях. Очень мало известно о роли НАДН в поддержании активности I стадии биотрансформации в гепатоцитах, хотя его синергичный эффект в НАДФН-зависимых реакциях окисления ксенобиотиков известен. Имеются лишь непрямые свидетельства использования цитозольного НАДН во время биотрансформации веществ в гепатоцитах; показано также, что агенты, увеличивающие уровень НАДН в цитозоле, стимулируют О-деметилиронание n-нитроанизола в изолированной перфузируемой печени. Поэтому для выяснения вопроса о роли НАДН в монооксигеназных реакциях in vivo требуется дальнейшая экспериментальная работа.
Вторым кофактором цитохром Р-450-зависимых реакций является О2. Сродство цитохрома Р-450 к молекулярному кислороду очень высоко; оно лишь незначительно меньше, чем у цитохромоксидазы. Величина кажущейся Км(О2) при окислении различных ксенобиотиков изолированными гепатоцитами сходна с тем, что получено для изолированных микросом и изолированной печени. Это говорит о том, что нет существенного градиента О2 между внеклеточным пространством и эндоплазматическим ретикулумом. Таким образом, в нормальных условиях кислород, видимо, не лимитирует скорость процесса биотрансформации ксенобиотиков. Однако в гипоксических условиях концентрация кислорода снижается и это может ограничивать биотрансформацию веществ в монооксигеназных реакциях, а также вести к восстановительной биотрансформации. При этом можно ожидать изменения путей образования и использования восстановительных эквивалентов, как это наблюдается на срезах печени. Вопрос этот, однако, остается малоизученным.