Значительная часть реакций, участвующих в метаболизме веществ в гепатоцитах, так же как в целой печени, катализируется оксигеназами смешанной функции, активность которых в конечном счете связана с группой гемопротеидов, известных под общим названием цитохрома Р-450. Их назначение заключается в окислительной деградации широкого спектра липофильных соединений, включая стероидные, а также полициклические углеводороды и обширный круг фармакологически активных соединений. Во всех этих реакциях один атом молекулярного кислорода внедряется в соответствующий субстрат и сопровождается окислением восстановленного пиридиннуклеотида.
Начальный компонент этой электронтранспортной редокс-цепи — мембраносвязанный флавопротеид НАДФН-цитохром-Р-450-редуктаза, содержащий в эквимолярных количествах ФАД и ФМН, специфичен для микросомальной фракции (в ней обнаружено 65- 85% его общей активности) и для оболочки ядра (30% его активности связывается с наружной мембраной ядра). Это и понятно, так как оболочка ядра и эндоплазматический ретикулум имеют общее происхождение и морфологически представляют единую структурно-непрерывную сеть.
В митохондриальной мембране гепатоцитов цитохром Р-450-зависимая монооксигеназная система представлена в минимальных количествах. Она катализирует некоторые биосинтетические процессы (синтез гормонов, витамина Д и др.) и характеризуется высокой субстратной специфичностью. Таким образом, она, видимо, не включается в процессы биотрансформации чужеродных веществ.
В гепатоцитах, как и в микросомальной фракции, цитохром Р-450 также представлен множественными формами. Однако их роль в метаболизме ксенобиотиков изучена мало. Точно установлено существование двух форм — цитохрома Р-450 LM2 и цитохрома Р-448 (известного также как цитохром Р-450 LM4). Ряд субстратов метаболизируется обеими формами, как, например, 7-этоксикумарин; другие — предпочтительно цитохромом Р-450 LM2 (этилморфин, бензфетамин); третьи окисляются главным образом с участием цитохрома Р-448 (7-этоксирезорфин).
Содержание общей фракции цитохрома Р-450 в свежевыделенных гепатоцитах близко к тому, что имеет место в интактной (или перфузируемой) печени. Следует иметь в виду, что содержание цитохрома Р-450 у разных видов животных может существенно различаться.
Содержание цитохрома Р-450 снижается в первый час инкубации гепатоцитов (в среднем на 20%), после чего наблюдается его стабилизация. При этом увеличивается содержание неактивной его формы — цитохрома Р-420. Содержание цитохрома Р-450 не зависит от состояния плазматической мембраны в широком диапазоне значений прокрашиваемости клеток.
Большая часть цитохрома Р-450 в изолированных клетках находится в окисленной, не связанной с субстратом форме. Субстраты микросомального окисления обнаруживают высокое сродство к цитохрому Р-450 и могут образовывать с ним, как и в изолированных микросомальных препаратах, в течение 1,5-2с комплексы I и II типа, что свидетельствует о конверсии части гемопротеиновой его формы из низкоспинового состояния в высокоспиновое. Однако эндогенные субстраты имеют преимущества в связывании с цитохромом Р-450 за счет более высокого сродства к нему. Комплексы связывания субстратов с цитохромом Р-450 регистрируются с помощью адсорбционного спектрофотометрического метода.
Для большинства исследованных веществ (алпренолол, гексобарбитал, лидокаин, SKF-525A и др.) спектральные изменения были сравнимы с тем, что получено на изолированных микросомах. Однако динамика спектральных изменений при этом была различной: в микросомах восстановление цитохрома Р-450 происходит практически одномоментно, в то время как в гепатоцитах оно протекает более медленно. Специфическое связывание вещества с цитохромом Р-450 в гепатоцитах в отличие от микросом исчезает по мере образования метаболитов.
Для веществ, дающих спектры I типа, удалось также зарегистрировать появление нового абсорбционного пика при λ=437нм, за которым следовал еще один пик при λ = 446нм.
Предполагается, что в случае с алпренололом эти пики отражают образование оксигенированной формы комплекса цитохром Р-450 — субстрат. Вещества, дающие в микросомах спектры II типа, в изолированных гепатоцитах образовывали смешанные спектры, включающие компоненты I и II типа. Процесс связывания субстратов микросомального окисления с цитохромом Р-450 сопровождается не только спектральными изменениями, но и соответствующей динамикой поверхностной флуоресценции и увеличением потребления кислорода.
Скорость метаболизирования субстратов микросомального окисления в гепатоцитах близка к скорости гидроксилирования в изолированной микросомальной+НАДФН-генерирующей системе.
Предварительное введение животным барбитуратов (фенобарбитала) или метилхолантрена в несколько раз увеличивает уровень содержания цитохрома Р-450 в гепатоцитах и скорость связывания с ксенобиотиками, оцениваемую спектрально.
Специфический ингибитор цитохром Р-450-оксигеназной активности SKF-525A одинаково подавляет метаболизм алпренолола в бифенил-4-гидроксилазную активность в гепатоцитах и микросомах. Она тесно связана с содержанием цитохрома Р-450 в клетке. При длительном (24ч и более) инкубировании гепатоцитов снова наблюдается снижение содержания цитохрома Р-450, что связано не только с усилением его деградации, но и с потерей клетками способности его синтезировать. Поэтому поддержание стабильного уровня цитохрома Р-450 представляет самостоятельную и очень важную проблему. Потеря цитохрома Р-450 в культуре частично предотвращается подбором специальных сред, включающих предшественника простетической группы цитохрома — 5-аминолевуленовую кислоту, которая усиливает гемоксигеназную активность, а также вещества, образующие с ним лиганды (например, пиридины типа метирапона). В среды не включаются также такие окислители, как цистеин и цистин.
Прямое воздействие фенобарбитала или бензантрацена на гепатоциты в культуре также приводит к увеличению содержания цитохрома Р-450 до значений, сравнимых с его уровнем в печени крыс, подвергнутых индукции этими веществами. Несмотря на это, скорость метаболизма веществ в цитохром Р-450-зависимой реакции в условиях культуры не достигает значений, наблюдаемых в свежеизолированных гепатоцитах или интактной печени.
Скорость окисления субстратов монооксигеназных реакций зависит от концентрации клеток. С увеличением последней скорость достоверно нарастает.