Пользовательский поиск

Механизмы регуляции энергосопряженного дыхания в клеточных системах

Гомеостатическая регуляция дыхания в аэробных клетках, свя­занная с производством АТФ, предполагает наличие соответствую­щих механизмов контроля скорости окислительных превращений.

Продолжение ниже

Запасы кислорода в природе и в организме человека

... вырабатывают в 20 - 30 раз больше кислорода, чем поглощают его в процессе дыхания. Развитие растительного мира значительно обогатило земную атмосферу ... ... строго ограничены. По мере его продвижения от атмосферного воздуха к клеткам, к их энергетическим станциям, митохондриям, кислорода в организме ...

Читать дальше...

всё на эту тему


В работах Ларди, Чанса и Уильямса было обращено внимание на гиперболическую зависимость между скоростью дыхания и внемитохондриальной концентрацией АДФ. Чанс развил эти наблюдения и сформулировал хорошо известные представления о пяти метаболических состояниях изолированных митохондрий, в каждом из которых поток электронов через дыхательную цепь лимитируется разными кинетическими причинами: либо снабжением субстратов окисления (состояние 1), либо концентрацией АДФ и фосфата, сопряженной с окислительным фосфорилированием (состояние 2), либо снабжением дыхательной цепи кислоро­дом в случае его дефицита (состояние 5). При наличии всех необходимых ингредиентов кинетический контроль дыхания осуществляется избытком внемитохондриального АДФ (состояние 3 — «ак­тивное»), после фосфорилирования которого устанавливается но­вое, более энергизованное состояние 4. Оно характеризуется дефи­цитом свободного АДФ, лимитирующего дыхание. Все эти измене­ния в изолированных митохондриях описываются кинетическими параметрами дыхания (изменениями скоростей потребления кис­лорода) и окислительно-восстановительными превращениями ды­хательных переносчиков, которые отражают общую способность дыхательной цепи поддерживать необходимую последовательность редокс-реакций для восстановления О3 до Н2О.

Тот факт, что ряд субстратов, участвующих в обеспечении спе­цифических функций печени, стимулирует дыхание и энергообра­зование в гепатоцитах, дало основание предполагать, что кон­троль и регуляция дыхания в интактной клетке могут осуществляться по аналогии с изолированными митохондриями. Поэтому имеются попытки описать функционально-метаболические измене­ния, наблюдаемые в гепатоцитах и перфузируемой печени с исполь­зованием терминологии Чанса. Так, например, считается, что клеточные препараты, полученные от го­лодных животных и окисляющие эндогенные субстраты, находят­ся в состоянии 1. Максимальная скорость дыхания в присутствии субстратов глюконеогенеза и синтеза мочевины может быть отражением состояния 3.

Однако такая классификация очень условна, так как в клетке в действительности, как правило, не бывает ограничения ни по суб­стратам, ни по АДФ, ни по фосфату, ни по кислороду. Тем не ме­нее in vivo клетки не дышат с максимальной скоростью, так как концентрации эндогенных субстратов дыхания в них не являются насыщающими. В то же время ограничения по какому-либо субстрату могут быть компенсированы активацией другого метаболического пути. В клетках печени голодных животных, напри­мер, обнаруживаются лишь следы гликогена. Однако электронтранспортная функция митохондриальной редокс-цепи поддерживается в этом состоянии окислением эндогенных жирных кислот и ее ак­тивность лишь незначительно снижается сравнительно с сытыми животными.

Интактные гепатоциты полноценны в функциональном отноше­нии, а это значит, что в них перманентно осуществляются специфи­ческие синтетические и катаболические процессы, из которых мно­гие энергозависимы. Благодаря этому дыхательная цепь даже при окислении одних только эндогенных субстратов находится в со­стоянии некоторой повышенной активности сравнительно с состоя­нием 2 или 4 в изолированных митохондриях и в них может быть избыток эндогенной АДФ. Именно поэтому, видимо, экзогенный АДФ не стимулирует дыхание гепатоцитов, так же как и срезов.

Известно, что в изолированных митохондриях отношение АТФ/АДФ в активном состоянии, характеризующемся максимальными скоростями дыхания, может достигать очень высоких значений (до 10) в присутствии внемитохондриальной АТФ-потребляющей системы. Сходные отношения могут быть получены и в изо­лированных гепатоцитах, выделенных из печени голодных живот­ных и инкубируемых с аланином, хотя скорость дыхания в этом случае немаксимальна. Действительно, в этих условиях олеат (1мМ) способен стимулировать дыхание еще примерно на 35%, хотя он уже не меняет значения АТФ/АДФ. Следова­тельно, контроль дыхания изолированных гепатоцитов в этом состоянии регулируется не одним только отношением АТФ/АДФ и ис­пользование классификации Чанса при описании их метаболиче­ского состояния имеет серьезные ограничения.

О существовании выраженных отличий в работе системы окис­лительного фосфорилирования в изолированных митохондриях и изолированных гепатоцитах говорит и расчет значений свободной энергии гидролиза АТФ (AG). В митохондриальной фракции гепа­тоцитов она была равна 12,0 кДж/моль, а в цитозольной фрак­ции — 20,3 кДж/моль, что существенно ниже, чем в реконструиро­ванной системе изолированных митохондрий в состоянии 3 и 4. До­бавление олеата к митохондриям увеличивало ее значения на 20%, а в изолированных гепатоцитах не влияло на него, т.е. ме­ханизмы контроля энергетической функции в интактных клетках и митохондриях in vitro могут отличаться. In vivo митохондрии ско­рее всего находятся в состоянии, промежуточном между 3-м и 4-м.

Об этом свидетельствует и редокс-состояние дыхательных пе­реносчиков в изолированной клетке. Несмотря на то что, как уже было показано, количественный состав дыхательных переносчиков митохондриальной редокс-цепи в гепатоцитах сходен с тем, что из­вестно для изолированных митохондрий, между ними имеются различия в степени восстановленности. Согласно данным Уилсона, в условиях максимального окисления дыхательной цепи ге­патоцитов цитохром с остается восстановленным на 10-30%, в среднем на 20% (в изолированных митохондриях — не более чем на 14%); цитохром а восстановлен даже несколько больше (в среднем на 23%, в то время как в изолированных митохондриях не более чем на 4%). Однако редокс-пара НАД+/НАДН находится в гепатоцитах в гораздо более окисленном состоянии, чем в изо­лированных митохондриях. Джоунс и соавторы приводят несколько более низкие значения степени восстановленности дыха­тельных переносчиков в клетках печени в условиях максимальной их окисленности.

Количественные различия в результатах, полученных в этих двух работах, не только связаны с неодинаковыми условиями вы­деления гепатоцитов, но и зависят от исходного состояния живот­ного. Так, Бюхер и Сис показали на перфузируемой печени, что степень восстановленности дыхательных компонентов в орга­не сытых животных в присутствии лактата и пирувата для цитохромов а+а3, и с+с1, была сходна со значениями, известными для изолированных митохондрий в состоянии 4; для цитохрома b — несколько выше, чем в митохондриях; для флавопротеинов — ни­же. В перфузируемой печени животных после 24ч голодания восстановленность всех дыхательных переносчиков, кроме цитохрома а+а3, и с+с1, была примерно в 2 раза ниже, чем в изолированных митохондриях в состоянии 3.

Однако самым главным отличительным моментом является то, что в клетке имеет место территориальное разделение энергосинтезирующих и энергопотребляющих процессов. Первые локализо­ваны главным образом в митохондриальном компартменте, вто­рые — во внемитохондриальном. Это определяет концентрационные различия между двумя компартментами прежде всего в отношении адениннуклеотидов. Относительно высокое содержание АДФ в митохондриях изолированных гепатоцитов является специ­фичным для них. Из всего этого следует, что для оценки энергетического обмена клетки важно знать не только концентрацию от­дельных метаболитов, но и их соотношение.

Наличие компартментализации адениннуклеотидов и связь цитоплазматического их пула с большинством эндергонических реак­ций явились причиной того, что на протяжении последних 10 лет активно обсуждается роль этого пула в регуляции митохондриаль­ного дыхания in vivo. В основе дискуссии лежат две альтернатив­ные точки зрения.

Одна из них постулирует, что контроль дыхания осуществляет­ся внемитохондриальным фосфорилирующим состоянием адениннуклеотидной системы, выраженным величиной фосфатного потен­циала [АТФ]/[АДФ] [Фн]. Авторы этой концепции экспериментально и теоретически обосновали существование термодинамического равновесия между внемитохон­дриальным фосфорилирующим состоянием адениловой системы и состоянием восстановленности редокс-пар на цитохромном участке дыхательной цепи, которое описывается уравнением

НАДН + 2 цит с3+ + 2АДФ + 2Фн = НАД+ + 2 цит с2+ + 2АТФ.

Константа этого уравнения может быть определена эксперимен­тально:

К = [НАД1-] [цит с2+]8 / [НАДН] [цит с3+]2 х [АДФ]2 / [АТФ]2 н]2

Как следует из последнего уравнения, дыхание определяется двумя независимыми переменными. Величина первой из них (зна­чение отношения [НАД+]/[НАДН]) зависит от поступления вос­становительных эквивалентов в дыхательную цепь, т.е. от работы ЦТК. Величина второй (отношение [АТФ]/[АДФ] [Фн] цитозоль­ного пула) определяется скоростью утилизации АТФ в клетке. Из­менения обеих переменных связаны друг с другом через отношения в первом и втором пунктах фосфорилирования. Следовательно, при постоянных значениях [АТФ]/[АДФ] [Фн] скорость митохондри­ального дыхания должна зависеть от внутримитохондриального от­ношения [НАД+]/[НАДН]. Но так как на участке НАД — цитохром с поддерживается термодинамическое равновесие, практи­чески можно говорить о зависимости дыхания от восстановленно­сти цитохрома с. И, наоборот, при постоянном отношении [НАД+]/[НАДН] и [цит с2+] можно наблюдать влияние отноше­ния [АТФ]/[АДФ] [Фн] на скорость дыхания. Таким образом, ана­лиз соотношения величины свободной энергии различных окисли­тельно-восстановительных этапов и реакций фосфорилирования АДФ устанавливает зависимость скорости дыхания не от концентрации отдельных реагентов, а от состояния фосфорилирования адениловой системы в целом и окислительно-восстановительного состоя­ния пары НАД (или цитохрома с).

Проверка возможности применения этой модели термодинами­ческого контроля дыхания была проведена на клеточных системах, в том числе и гепатоцитах. Во всех случаях авторам уда­лось как будто бы продемонстрировать, что изменения свободной энергии на участке НАДН — цитохром с, сопряженные с переносом восстановительных эквивалентов, были практически равны свободной энергии синтеза двух молей АТФ из АДФ и Фн. При увеличе­нии энергетических трат, связанных с активностью клетки, измене­ния концентрации внутриклеточного фосфата влияли на величину отношения [АТФ]/[АДФ] таким образом, что в целом поддержи­вались постоянство внемитохондриального фосфатного потенциала и скорость дыхания.

Однако равновесная система может работать только в том слу­чае, если она имеет неравновесную стадию, контролирующую весь общий поток восстановительных эквивалентов. Так как окисли­тельно-восстановительные реакции дыхательной цепи митохондрий находятся в практическом равновесии с реакциями фосфорилиро­вания, то и все промежуточные стадии на участке НАД — цитохром с также должны находиться в равновесии. Следовательно, дыха­тельный контроль может осуществляться либо на субстратном уча­стке дыхательной цепи через митохондриальный переносчик АДФ и АТФ, либо в реакциях на участке цитохром — кислород. По мнению Уилсона и соавторов, единственной неравновес­ной реакцией, обладающей достаточно большой величиной свобод­ной энергии в условиях прочно сопряженных митохондрий (т.е. при высоких значениях [АТФ]/[АДФ] [Фн]) является восстановление кислорода цитохромом а. Именно это делает его потенциальным объектом регулирования через изменение редокс-состояния пред­шествующего переносчика и наиболее вероятным претендентом на роль регуляторной стадии в процессе синтеза АТФ. Дыхательный контроль, согласно термодинамической модели, осуществляется через нарушение термодинамического равновесия на терминальном участке дыхательной цепи.

Альтернативная точка зрения была выдвинута и обоснована двумя группами авторов во главе с Дэвисом и Кунцем. Согласно их представлениям, скорость митохондриаль­ного дыхания зависит не только от внемитохондриального отноше­ния [АТФ]/[АДФ] [Фн], но в большей степени от внемитохондри­ального отношения [АТФ]/[АДФ], и эта зависимость является следствием кинетического контроля дыхания адениннуклеотидтранслоказой.

Известно, что внутримитохондриальная мембрана непроницае­ма для АДФ и АТФ. Их перенос осуществляется путем электрогенного обмена АТФn-/АДФn-1, опосредованного мембранным потен­циалом с помощью специфического переносчика, локализованного на внутренней мембране митохондрий — адениннуклеотидтранслоказы. В неэнергизованной мембране транспорт адениннуклеотидов является симметричным. Энергизованный обмен идет по гра­диенту электрохимического потенциала и регулируется в пользу поглощения АДФ (в виде аниона АДФn-1) и выброса АТФ (в виде аниона АТФn-); он контролируется величиной мембранного потен­циала на митохондриальной мембране, генерируемого в ходе транспорта электронов в дыхательной цепи, т.е. является энергозависимым.

Вопрос о значимости адениннуклеотидтранслоказы в регуляции дыхания был решен Еречинской, Уилсоном и сотрудниками отрицательно, так как ими было показано, что в прочно сопряженных митохондриях перенос АТФ и АДФ происходит без потери свободной энергии и различия в фосфатных потенциалах митохондрий и цитозоля обусловлены ионным градиентом и/или потенциалом на внутренней мембране митохондрий. Однако для расчетов значений внемитохондриального фосфатного потенциала ими использовались значения общего внутриклеточного содержания АТФ, АДФ и Фн без учета компартментализации последних. При внесении соответствующих коррекций оказалось, что реакция переноса адениннуклеотидов неравновесна даже в состоянии покоя. Эта неравновесность повышается с увеличением скорости ды­хания, стимулируемого различными реакциями, потребляющими АТФ, в частности синтезом цитруллина, и не зависит от ме­ста утилизации АТФ. Наличие изменения свободной энергии для реакций переноса адениннуклеотидов было предсказано также и с помощью теоретических расчетов.

Прямые свидетельства в пользу роли адениннуклеотидтрансло­казы в контроле дыхания в условиях клеточной системы были по­лучены Акербумом и др. на гепатоцитах. При титровании атрактилозидом — ингибитором адениннуклеотидтранслоказы — ими было обнаружено градуальное подавление дыхания и образо­вания АТФ в клетках. Эти данные были подтверждены Гроеном и соавторами, которым удалось показать, что в изолированных гепатоцитах адениннуклеотидтранслоказа, действительно, лимити­рует скорость окислительного фосфорилирования во время глюконеогенеза из лактата: увеличение концентрации атрактилозида приводило к параллельному снижению скорости глюконеогенеза и соответствующего образования глюкозы и подавлению дыхания. Еще одно подтверждение значимости системы транслокации адениннуклеотидов в контроле дыхания было получено на перфузируемой печени, для которой показано наличие существенной разницы в величине гидролиза АТФ в митохондриях и цитозоле, достигаю­щей у сытых животных 11 кДж/моль, а у голодных — 3 кДж/моль. Т.е. экспорт АТФ из митохондрий, действительно, является энергопотребляющим процессом. Таким образом, общие принципы регуляции и контроля дыхания, показанные на модельных систе­мах, сохраняются в клетке.

В дискуссии о контроле дыхания спорным оказался также воп­рос о роли неорганического фосфата, который по мнению Еречинской, Уилсона и соавторов, является обязательным компонен­том регуляторной системы дыхания и включается в характеристики степени фосфорилирования адениловой системы. Способность клет­ки регулировать поступление Фн из внеклеточной среды известна. Согласно авторам, влияние различных концепций Фн на дыхание обратно тому, что имеет место для АТФ. Применительно к клетке это означает необходимость компартментализации Фн по градиен­ту цитозоль —> митохондрии.

Однако наличие такой компартментализации в клетках печени экспериментально не подтверждается. Согласно данным Соболла и соавторов, полученным на перфузируемой печени, Фн рав­номерно распределен между митохондриальным и внемитохондриальным компартментами. В отличие от этого Акербум и соавторы показали, что в изолированных гепатоцитах существует до­статочно высокий концентрационный градиент для Фн-митохондрии/цитозоль — 5,0, величина которого не менялась при активации дыхания олеатом. Несмотря на неоднозначность этих данных, что может быть обусловлено методическими причинами, они свиде­тельствуют против ожидаемого распределения Фн по Уилсону.

Дэвис в связи с исследованием этого вопроса на мо­дельной системе показал, что регуляторная роль фосфатного по­тенциала имеет место лишь в области очень низких, нефизиологи­ческих концентраций неорганического фосфата (менее 3мМ). В физиологических же условиях лимитирующим звеном процесса является внемитохондриальное отношение АТФ/АДФ, стационар­ное состояние которого, близкое к равновесному, поддерживается за счет гидролиза АТФ во время работы клетки. Именно это отно­шение определяет поступление АТФ в митохондрии и тем самым скорость дыхания через сопряженное фосфорилирование. Зависи­мость дыхания от этого отношения при любых концентрациях Фн выражена гораздо больше, чем от фосфатного потенциала. К ана­логичным выводам пришли Кунц с соавторами. Последним удалось показать также, что действие фосфата на дыхание доста­точно заметно лишь при очень низких значениях внемитохондриального отношения [АТФ]/[АДФ]. Наличие неравновесного состояния на участке адениннуклеотидтранслоказы было подтвер­ждено экспериментально Уондерсом, который показал, что изменение свободной энергии при переносе адениннуклеотидов в состоянии 3, когда дыхание активировано на 30%, составляет 8кДж. Существование неравновесного состояния на участке адениннуклеотидтранслоказы было доказано также с помощью теоре­тических расчетов.

Противоречивость получаемого экспериментального материала, сложность его интерпретации, многочисленные отклонения, исклю­чения и ограничения, не позволяющие категорически принять ка­кую-либо одну точку зрения в обсуждаемой дискуссии, наталкива­ли на мысль, что решение вопроса о контроле дыхания не может быть однозначным и в такой многопараметрической и полифункциональной системе, как клетка, энергетический обмен контроли­руется более чем одной реакцией. В связи с этим высказы­вались даже соображения о том, что вся система окислительного фосфорилирования далека от термодинамического равновесия, по­этому процесс утилизации кислорода может быть лучше описан в терминах неравновесной термодинамики.

Существенный прогресс в понимании механизмов регуляции ды­хания был достигнут благодаря использованию нового методиче­ского приема — оценке эффективности (или силы) ферментативно­го контроля (контролирующей силы) (control strength) процесса окислительного фосфорилирования. Смысл этого понятия заключается в количественной оценке относительного уча­стия различных ферментов и сопряженных с ними реакций в регу­ляции изучаемого процесса в целом в данном стационарном состоя­нии. Контролирующая сила (с) может быть рассчитана согласно следующему математическому выражению:

С = [(dJ/J) / (de/e)] х SS,

где J — метаболический поток (например, дыхание) в данном ста­ционарном состоянии; dJ — его изменения в связи с каким-либо воздействием; е — концентрация фермента; de — ее изменения под влиянием того же воздействия; SS — стационарное состояние. Если начальная и конечная концентрации субстрата и продукта соответственно в данном метаболическом состоянии постоянны, сумма всех контролирующих метаболический поток сил должна быть равна единице. Чтобы определить эффективность контроля дыхания одним каким-либо ферментом, необходимо измерить влия­ние бесконечно малых изменений его активности на ход метаболи­ческого процесса в целом, которое оценивается по какой-либо сум­марной реакции (например, дыханию), участвующей в этом мета­болическом процессе.

Практически для выявления роли различных ферментов регу­ляции окислительного фосфорилирования используют специфические их ингибиторы и возможность с их помощью влиять на дыха­ние в данном стационарном состоянии. Тогда эффективность кон­троля данного фермента может быть рассчитана по формуле:

С = (dJ/J) / (dI/Iмакс), где Iмакс — количество ингибитора, необходимое для полного по­давления активности фермента; dl — его количество, при котором регистрируется изменение потока.

Рассмотрим это на примере титрования митохондрий печени крысы карбоксиатрактилозидом — специфическим необратимым ингибитором адениннуклеотидтранслоказы. Изменения в скоростях дыхания достигались добавлением глюкозы и гексокиназы в различных концентрациях в присутствии сукцината (20мМ) и малата (2мМ), так что концентрации субстратов и продуктов окисле­ния существенно не менялись за сравнительно короткое время ин­кубации. Для этих же целей использовали высокие концентрации глюкозы (20мМ) и фосфата (10мМ).

Эффективность контроля дыхания адениннуклеотидтранслоказой оценивали путем измерения начальных изменений скоростей дыхания в присутствии ингибитора. Как было замечено, контролирую­щая сила адениннуклеотидтранслоказы в состоянии 4 равна 0 и до­стигает максимума при увеличении скорости дыхания на 80% (со­стояние 3). Она всегда меньше единицы, что подтверждает нали­чие наряду с адениннуклеотидтранслоказой других реакций, кон­тролирующих дыхание. В состоянии 4 предполагаемым регулято­ром дыхания может быть пассивная проницаемость протона через митохондриальную мембрану. Проверка этой гипотезы показала, что эффективная сила контроля протонного обмена была макси­мальной в состоянии покоя и прогрессивно уменьшалась при усилении дыхания и приближении к состоянию 3. В промежуточном состоянии и в состоянии 3 контроль дыхания осуществляется множественными реакциями, связанными с активностью разных ферментов, так что невозможно говорить о единственном лимитирующем звене окислительного фосфорилирования.

Также было замечено, что суммарная сила контроля мень­ше единицы, т.е. в рассмотренном случае в регуляции дыхания принимают участие реакции, которые не были учтены при расче­тах. В связи с этим следует, по-видимому, признать, что модели, в которых контроль дыхания связывался либо исключительно только с цитохромоксидазой, либо с адениннуклеотидтранслоказой, требуют пересмотра и модификаций.

Таким образом, митохондриальное дыхание находится под конт­ролем множественных реакций и ферментных систем, значимость которых может меняться в зависимости от функционально-метабо­лического состояния. Распределение контроля среди всех этих звеньев является функцией скорости дыхания и зависит не только от мощности потока через дыхательную цепь, но и от метаболического пути, которым этот поток был вызван. Наконец, распределение эффективной силы контроля между различными фер­ментными реакциями находится в большой зависимости от экспе­риментальных условий, например от концентрации АТФ.

В заключение следует отметить, что оценка эффективной силы контроля в интактных клетках очень сложна, так как АТФ-регенерирующая система в цитозоле связана одновременно с активностью многих процессов. Поэтому простая экстраполяция результатов, по­лученных на изолированных митохондриях, на клеточную систему, видимо, невозможна. Трудно, например, предсказать, каковы абсо­лютные значения контролирующей силы адениннуклеотидтрансло­казы в интактной клетке. Тем не менее попытка таких расчетов бы­ла предпринята на гепатоците. При некоторых допущениях и использовании количественных данных Акербума о содер­жании свободных АТФ и АДФ в гепатоцитах во время глюконеоге­неза из лактата было определено, что минимальная контролирую­щая сила адениннуклеотидтранслоказы равна 0,34. Это значит, что в условиях, описанных Акербумом и Штаббсом, она действительно, может быть лимитирующим звеном окислительно­го фосфорилирования в интактных клетках.

Все это позволяет предполагать, что общие принципы контроля дыхания и окислительного фосфорилирования, установленные на модельных системах, получат свое подтверждение в условиях in vivo.




© Авторы и рецензенты: редакционный коллектив оздоровительного портала "На здоровье!". Все права защищены.


 
Текст сообщения*
Защита от автоматических сообщений
Загрузить изображение
 

nazdor.ru
На здоровье!
Беременность | Лечение | Энциклопедия | Статьи | Врачи и клиники | Сообщество


О проектеКарта сайта β На здоровье! © 2008—2015
nazdor.ru, nazdor.com
Контакты Наш устав

Рекомендации и мнения, опубликованные на сайте, являются справочными или популярными и предоставляются широкому кругу читателей для обсуждения. Указанная информация не заменяет квалифицированную медицинскую помощь, основанную на истории болезни и результатах диагностики. Обязательно проконсультируйтесь с врачом.

Размещенные на сайте информационные материалы, включая статьи, могут содержать информацию, предназначенную для пользователей старше 18 лет согласно Федеральному закону №436-ФЗ от 29.12.2010 года "О защите детей от информации, причиняющей вред их здоровью и развитию".