Гомеостатическая регуляция дыхания в аэробных клетках, связанная с производством АТФ, предполагает наличие соответствующих механизмов контроля скорости окислительных превращений.
В работах Ларди, Чанса и Уильямса было обращено внимание на гиперболическую зависимость между скоростью дыхания и внемитохондриальной концентрацией АДФ. Чанс развил эти наблюдения и сформулировал хорошо известные представления о пяти метаболических состояниях изолированных митохондрий, в каждом из которых поток электронов через дыхательную цепь лимитируется разными кинетическими причинами: либо снабжением субстратов окисления (состояние 1), либо концентрацией АДФ и фосфата, сопряженной с окислительным фосфорилированием (состояние 2), либо снабжением дыхательной цепи кислородом в случае его дефицита (состояние 5). При наличии всех необходимых ингредиентов кинетический контроль дыхания осуществляется избытком внемитохондриального АДФ (состояние 3 — «активное»), после фосфорилирования которого устанавливается новое, более энергизованное состояние 4. Оно характеризуется дефицитом свободного АДФ, лимитирующего дыхание. Все эти изменения в изолированных митохондриях описываются кинетическими параметрами дыхания (изменениями скоростей потребления кислорода) и окислительно-восстановительными превращениями дыхательных переносчиков, которые отражают общую способность дыхательной цепи поддерживать необходимую последовательность редокс-реакций для восстановления О3 до Н2О.
Тот факт, что ряд субстратов, участвующих в обеспечении специфических функций печени, стимулирует дыхание и энергообразование в гепатоцитах, дало основание предполагать, что контроль и регуляция дыхания в интактной клетке могут осуществляться по аналогии с изолированными митохондриями. Поэтому имеются попытки описать функционально-метаболические изменения, наблюдаемые в гепатоцитах и перфузируемой печени с использованием терминологии Чанса. Так, например, считается, что клеточные препараты, полученные от голодных животных и окисляющие эндогенные субстраты, находятся в состоянии 1. Максимальная скорость дыхания в присутствии субстратов глюконеогенеза и синтеза мочевины может быть отражением состояния 3.
Однако такая классификация очень условна, так как в клетке в действительности, как правило, не бывает ограничения ни по субстратам, ни по АДФ, ни по фосфату, ни по кислороду. Тем не менее in vivo клетки не дышат с максимальной скоростью, так как концентрации эндогенных субстратов дыхания в них не являются насыщающими. В то же время ограничения по какому-либо субстрату могут быть компенсированы активацией другого метаболического пути. В клетках печени голодных животных, например, обнаруживаются лишь следы гликогена. Однако электронтранспортная функция митохондриальной редокс-цепи поддерживается в этом состоянии окислением эндогенных жирных кислот и ее активность лишь незначительно снижается сравнительно с сытыми животными.
Интактные гепатоциты полноценны в функциональном отношении, а это значит, что в них перманентно осуществляются специфические синтетические и катаболические процессы, из которых многие энергозависимы. Благодаря этому дыхательная цепь даже при окислении одних только эндогенных субстратов находится в состоянии некоторой повышенной активности сравнительно с состоянием 2 или 4 в изолированных митохондриях и в них может быть избыток эндогенной АДФ. Именно поэтому, видимо, экзогенный АДФ не стимулирует дыхание гепатоцитов, так же как и срезов.
Известно, что в изолированных митохондриях отношение АТФ/АДФ в активном состоянии, характеризующемся максимальными скоростями дыхания, может достигать очень высоких значений (до 10) в присутствии внемитохондриальной АТФ-потребляющей системы. Сходные отношения могут быть получены и в изолированных гепатоцитах, выделенных из печени голодных животных и инкубируемых с аланином, хотя скорость дыхания в этом случае немаксимальна. Действительно, в этих условиях олеат (1мМ) способен стимулировать дыхание еще примерно на 35%, хотя он уже не меняет значения АТФ/АДФ. Следовательно, контроль дыхания изолированных гепатоцитов в этом состоянии регулируется не одним только отношением АТФ/АДФ и использование классификации Чанса при описании их метаболического состояния имеет серьезные ограничения.
О существовании выраженных отличий в работе системы окислительного фосфорилирования в изолированных митохондриях и изолированных гепатоцитах говорит и расчет значений свободной энергии гидролиза АТФ (AG). В митохондриальной фракции гепатоцитов она была равна 12,0 кДж/моль, а в цитозольной фракции — 20,3 кДж/моль, что существенно ниже, чем в реконструированной системе изолированных митохондрий в состоянии 3 и 4. Добавление олеата к митохондриям увеличивало ее значения на 20%, а в изолированных гепатоцитах не влияло на него, т.е. механизмы контроля энергетической функции в интактных клетках и митохондриях in vitro могут отличаться. In vivo митохондрии скорее всего находятся в состоянии, промежуточном между 3-м и 4-м.
Об этом свидетельствует и редокс-состояние дыхательных переносчиков в изолированной клетке. Несмотря на то что, как уже было показано, количественный состав дыхательных переносчиков митохондриальной редокс-цепи в гепатоцитах сходен с тем, что известно для изолированных митохондрий, между ними имеются различия в степени восстановленности. Согласно данным Уилсона, в условиях максимального окисления дыхательной цепи гепатоцитов цитохром с остается восстановленным на 10-30%, в среднем на 20% (в изолированных митохондриях — не более чем на 14%); цитохром а восстановлен даже несколько больше (в среднем на 23%, в то время как в изолированных митохондриях не более чем на 4%). Однако редокс-пара НАД+/НАДН находится в гепатоцитах в гораздо более окисленном состоянии, чем в изолированных митохондриях. Джоунс и соавторы приводят несколько более низкие значения степени восстановленности дыхательных переносчиков в клетках печени в условиях максимальной их окисленности.
Количественные различия в результатах, полученных в этих двух работах, не только связаны с неодинаковыми условиями выделения гепатоцитов, но и зависят от исходного состояния животного. Так, Бюхер и Сис показали на перфузируемой печени, что степень восстановленности дыхательных компонентов в органе сытых животных в присутствии лактата и пирувата для цитохромов а+а3, и с+с1, была сходна со значениями, известными для изолированных митохондрий в состоянии 4; для цитохрома b — несколько выше, чем в митохондриях; для флавопротеинов — ниже. В перфузируемой печени животных после 24ч голодания восстановленность всех дыхательных переносчиков, кроме цитохрома а+а3, и с+с1, была примерно в 2 раза ниже, чем в изолированных митохондриях в состоянии 3.
Однако самым главным отличительным моментом является то, что в клетке имеет место территориальное разделение энергосинтезирующих и энергопотребляющих процессов. Первые локализованы главным образом в митохондриальном компартменте, вторые — во внемитохондриальном. Это определяет концентрационные различия между двумя компартментами прежде всего в отношении адениннуклеотидов. Относительно высокое содержание АДФ в митохондриях изолированных гепатоцитов является специфичным для них. Из всего этого следует, что для оценки энергетического обмена клетки важно знать не только концентрацию отдельных метаболитов, но и их соотношение.
Наличие компартментализации адениннуклеотидов и связь цитоплазматического их пула с большинством эндергонических реакций явились причиной того, что на протяжении последних 10 лет активно обсуждается роль этого пула в регуляции митохондриального дыхания in vivo. В основе дискуссии лежат две альтернативные точки зрения.
Одна из них постулирует, что контроль дыхания осуществляется внемитохондриальным фосфорилирующим состоянием адениннуклеотидной системы, выраженным величиной фосфатного потенциала [АТФ]/[АДФ] [Фн]. Авторы этой концепции экспериментально и теоретически обосновали существование термодинамического равновесия между внемитохондриальным фосфорилирующим состоянием адениловой системы и состоянием восстановленности редокс-пар на цитохромном участке дыхательной цепи, которое описывается уравнением
НАДН + 2 цит с3+ + 2АДФ + 2Фн = НАД+ + 2 цит с2+ + 2АТФ.
Константа этого уравнения может быть определена экспериментально:
К = [НАД1-] [цит с2+]8 / [НАДН] [цит с3+]2 х [АДФ]2 / [АТФ]2 [Фн]2
Как следует из последнего уравнения, дыхание определяется двумя независимыми переменными. Величина первой из них (значение отношения [НАД+]/[НАДН]) зависит от поступления восстановительных эквивалентов в дыхательную цепь, т.е. от работы ЦТК. Величина второй (отношение [АТФ]/[АДФ] [Фн] цитозольного пула) определяется скоростью утилизации АТФ в клетке. Изменения обеих переменных связаны друг с другом через отношения в первом и втором пунктах фосфорилирования. Следовательно, при постоянных значениях [АТФ]/[АДФ] [Фн] скорость митохондриального дыхания должна зависеть от внутримитохондриального отношения [НАД+]/[НАДН]. Но так как на участке НАД — цитохром с поддерживается термодинамическое равновесие, практически можно говорить о зависимости дыхания от восстановленности цитохрома с. И, наоборот, при постоянном отношении [НАД+]/[НАДН] и [цит с2+] можно наблюдать влияние отношения [АТФ]/[АДФ] [Фн] на скорость дыхания. Таким образом, анализ соотношения величины свободной энергии различных окислительно-восстановительных этапов и реакций фосфорилирования АДФ устанавливает зависимость скорости дыхания не от концентрации отдельных реагентов, а от состояния фосфорилирования адениловой системы в целом и окислительно-восстановительного состояния пары НАД (или цитохрома с).
Проверка возможности применения этой модели термодинамического контроля дыхания была проведена на клеточных системах, в том числе и гепатоцитах. Во всех случаях авторам удалось как будто бы продемонстрировать, что изменения свободной энергии на участке НАДН — цитохром с, сопряженные с переносом восстановительных эквивалентов, были практически равны свободной энергии синтеза двух молей АТФ из АДФ и Фн. При увеличении энергетических трат, связанных с активностью клетки, изменения концентрации внутриклеточного фосфата влияли на величину отношения [АТФ]/[АДФ] таким образом, что в целом поддерживались постоянство внемитохондриального фосфатного потенциала и скорость дыхания.
Однако равновесная система может работать только в том случае, если она имеет неравновесную стадию, контролирующую весь общий поток восстановительных эквивалентов. Так как окислительно-восстановительные реакции дыхательной цепи митохондрий находятся в практическом равновесии с реакциями фосфорилирования, то и все промежуточные стадии на участке НАД — цитохром с также должны находиться в равновесии. Следовательно, дыхательный контроль может осуществляться либо на субстратном участке дыхательной цепи через митохондриальный переносчик АДФ и АТФ, либо в реакциях на участке цитохром — кислород. По мнению Уилсона и соавторов, единственной неравновесной реакцией, обладающей достаточно большой величиной свободной энергии в условиях прочно сопряженных митохондрий (т.е. при высоких значениях [АТФ]/[АДФ] [Фн]) является восстановление кислорода цитохромом а. Именно это делает его потенциальным объектом регулирования через изменение редокс-состояния предшествующего переносчика и наиболее вероятным претендентом на роль регуляторной стадии в процессе синтеза АТФ. Дыхательный контроль, согласно термодинамической модели, осуществляется через нарушение термодинамического равновесия на терминальном участке дыхательной цепи.
Альтернативная точка зрения была выдвинута и обоснована двумя группами авторов во главе с Дэвисом и Кунцем. Согласно их представлениям, скорость митохондриального дыхания зависит не только от внемитохондриального отношения [АТФ]/[АДФ] [Фн], но в большей степени от внемитохондриального отношения [АТФ]/[АДФ], и эта зависимость является следствием кинетического контроля дыхания адениннуклеотидтранслоказой.
Известно, что внутримитохондриальная мембрана непроницаема для АДФ и АТФ. Их перенос осуществляется путем электрогенного обмена АТФn-/АДФn-1, опосредованного мембранным потенциалом с помощью специфического переносчика, локализованного на внутренней мембране митохондрий — адениннуклеотидтранслоказы. В неэнергизованной мембране транспорт адениннуклеотидов является симметричным. Энергизованный обмен идет по градиенту электрохимического потенциала и регулируется в пользу поглощения АДФ (в виде аниона АДФn-1) и выброса АТФ (в виде аниона АТФn-); он контролируется величиной мембранного потенциала на митохондриальной мембране, генерируемого в ходе транспорта электронов в дыхательной цепи, т.е. является энергозависимым.
Вопрос о значимости адениннуклеотидтранслоказы в регуляции дыхания был решен Еречинской, Уилсоном и сотрудниками отрицательно, так как ими было показано, что в прочно сопряженных митохондриях перенос АТФ и АДФ происходит без потери свободной энергии и различия в фосфатных потенциалах митохондрий и цитозоля обусловлены ионным градиентом и/или потенциалом на внутренней мембране митохондрий. Однако для расчетов значений внемитохондриального фосфатного потенциала ими использовались значения общего внутриклеточного содержания АТФ, АДФ и Фн без учета компартментализации последних. При внесении соответствующих коррекций оказалось, что реакция переноса адениннуклеотидов неравновесна даже в состоянии покоя. Эта неравновесность повышается с увеличением скорости дыхания, стимулируемого различными реакциями, потребляющими АТФ, в частности синтезом цитруллина, и не зависит от места утилизации АТФ. Наличие изменения свободной энергии для реакций переноса адениннуклеотидов было предсказано также и с помощью теоретических расчетов.
Прямые свидетельства в пользу роли адениннуклеотидтранслоказы в контроле дыхания в условиях клеточной системы были получены Акербумом и др. на гепатоцитах. При титровании атрактилозидом — ингибитором адениннуклеотидтранслоказы — ими было обнаружено градуальное подавление дыхания и образования АТФ в клетках. Эти данные были подтверждены Гроеном и соавторами, которым удалось показать, что в изолированных гепатоцитах адениннуклеотидтранслоказа, действительно, лимитирует скорость окислительного фосфорилирования во время глюконеогенеза из лактата: увеличение концентрации атрактилозида приводило к параллельному снижению скорости глюконеогенеза и соответствующего образования глюкозы и подавлению дыхания. Еще одно подтверждение значимости системы транслокации адениннуклеотидов в контроле дыхания было получено на перфузируемой печени, для которой показано наличие существенной разницы в величине гидролиза АТФ в митохондриях и цитозоле, достигающей у сытых животных 11 кДж/моль, а у голодных — 3 кДж/моль. Т.е. экспорт АТФ из митохондрий, действительно, является энергопотребляющим процессом. Таким образом, общие принципы регуляции и контроля дыхания, показанные на модельных системах, сохраняются в клетке.
В дискуссии о контроле дыхания спорным оказался также вопрос о роли неорганического фосфата, который по мнению Еречинской, Уилсона и соавторов, является обязательным компонентом регуляторной системы дыхания и включается в характеристики степени фосфорилирования адениловой системы. Способность клетки регулировать поступление Фн из внеклеточной среды известна. Согласно авторам, влияние различных концепций Фн на дыхание обратно тому, что имеет место для АТФ. Применительно к клетке это означает необходимость компартментализации Фн по градиенту цитозоль —> митохондрии.
Однако наличие такой компартментализации в клетках печени экспериментально не подтверждается. Согласно данным Соболла и соавторов, полученным на перфузируемой печени, Фн равномерно распределен между митохондриальным и внемитохондриальным компартментами. В отличие от этого Акербум и соавторы показали, что в изолированных гепатоцитах существует достаточно высокий концентрационный градиент для Фн-митохондрии/цитозоль — 5,0, величина которого не менялась при активации дыхания олеатом. Несмотря на неоднозначность этих данных, что может быть обусловлено методическими причинами, они свидетельствуют против ожидаемого распределения Фн по Уилсону.
Дэвис в связи с исследованием этого вопроса на модельной системе показал, что регуляторная роль фосфатного потенциала имеет место лишь в области очень низких, нефизиологических концентраций неорганического фосфата (менее 3мМ). В физиологических же условиях лимитирующим звеном процесса является внемитохондриальное отношение АТФ/АДФ, стационарное состояние которого, близкое к равновесному, поддерживается за счет гидролиза АТФ во время работы клетки. Именно это отношение определяет поступление АТФ в митохондрии и тем самым скорость дыхания через сопряженное фосфорилирование. Зависимость дыхания от этого отношения при любых концентрациях Фн выражена гораздо больше, чем от фосфатного потенциала. К аналогичным выводам пришли Кунц с соавторами. Последним удалось показать также, что действие фосфата на дыхание достаточно заметно лишь при очень низких значениях внемитохондриального отношения [АТФ]/[АДФ]. Наличие неравновесного состояния на участке адениннуклеотидтранслоказы было подтверждено экспериментально Уондерсом, который показал, что изменение свободной энергии при переносе адениннуклеотидов в состоянии 3, когда дыхание активировано на 30%, составляет 8кДж. Существование неравновесного состояния на участке адениннуклеотидтранслоказы было доказано также с помощью теоретических расчетов.
Противоречивость получаемого экспериментального материала, сложность его интерпретации, многочисленные отклонения, исключения и ограничения, не позволяющие категорически принять какую-либо одну точку зрения в обсуждаемой дискуссии, наталкивали на мысль, что решение вопроса о контроле дыхания не может быть однозначным и в такой многопараметрической и полифункциональной системе, как клетка, энергетический обмен контролируется более чем одной реакцией. В связи с этим высказывались даже соображения о том, что вся система окислительного фосфорилирования далека от термодинамического равновесия, поэтому процесс утилизации кислорода может быть лучше описан в терминах неравновесной термодинамики.
Существенный прогресс в понимании механизмов регуляции дыхания был достигнут благодаря использованию нового методического приема — оценке эффективности (или силы) ферментативного контроля (контролирующей силы) (control strength) процесса окислительного фосфорилирования. Смысл этого понятия заключается в количественной оценке относительного участия различных ферментов и сопряженных с ними реакций в регуляции изучаемого процесса в целом в данном стационарном состоянии. Контролирующая сила (с) может быть рассчитана согласно следующему математическому выражению:
С = [(dJ/J) / (de/e)] х SS,
где J — метаболический поток (например, дыхание) в данном стационарном состоянии; dJ — его изменения в связи с каким-либо воздействием; е — концентрация фермента; de — ее изменения под влиянием того же воздействия; SS — стационарное состояние. Если начальная и конечная концентрации субстрата и продукта соответственно в данном метаболическом состоянии постоянны, сумма всех контролирующих метаболический поток сил должна быть равна единице. Чтобы определить эффективность контроля дыхания одним каким-либо ферментом, необходимо измерить влияние бесконечно малых изменений его активности на ход метаболического процесса в целом, которое оценивается по какой-либо суммарной реакции (например, дыханию), участвующей в этом метаболическом процессе.
Практически для выявления роли различных ферментов регуляции окислительного фосфорилирования используют специфические их ингибиторы и возможность с их помощью влиять на дыхание в данном стационарном состоянии. Тогда эффективность контроля данного фермента может быть рассчитана по формуле:
С = (dJ/J) / (dI/Iмакс), где Iмакс — количество ингибитора, необходимое для полного подавления активности фермента; dl — его количество, при котором регистрируется изменение потока.
Рассмотрим это на примере титрования митохондрий печени крысы карбоксиатрактилозидом — специфическим необратимым ингибитором адениннуклеотидтранслоказы. Изменения в скоростях дыхания достигались добавлением глюкозы и гексокиназы в различных концентрациях в присутствии сукцината (20мМ) и малата (2мМ), так что концентрации субстратов и продуктов окисления существенно не менялись за сравнительно короткое время инкубации. Для этих же целей использовали высокие концентрации глюкозы (20мМ) и фосфата (10мМ).
Эффективность контроля дыхания адениннуклеотидтранслоказой оценивали путем измерения начальных изменений скоростей дыхания в присутствии ингибитора. Как было замечено, контролирующая сила адениннуклеотидтранслоказы в состоянии 4 равна 0 и достигает максимума при увеличении скорости дыхания на 80% (состояние 3). Она всегда меньше единицы, что подтверждает наличие наряду с адениннуклеотидтранслоказой других реакций, контролирующих дыхание. В состоянии 4 предполагаемым регулятором дыхания может быть пассивная проницаемость протона через митохондриальную мембрану. Проверка этой гипотезы показала, что эффективная сила контроля протонного обмена была максимальной в состоянии покоя и прогрессивно уменьшалась при усилении дыхания и приближении к состоянию 3. В промежуточном состоянии и в состоянии 3 контроль дыхания осуществляется множественными реакциями, связанными с активностью разных ферментов, так что невозможно говорить о единственном лимитирующем звене окислительного фосфорилирования.
Также было замечено, что суммарная сила контроля меньше единицы, т.е. в рассмотренном случае в регуляции дыхания принимают участие реакции, которые не были учтены при расчетах. В связи с этим следует, по-видимому, признать, что модели, в которых контроль дыхания связывался либо исключительно только с цитохромоксидазой, либо с адениннуклеотидтранслоказой, требуют пересмотра и модификаций.
Таким образом, митохондриальное дыхание находится под контролем множественных реакций и ферментных систем, значимость которых может меняться в зависимости от функционально-метаболического состояния. Распределение контроля среди всех этих звеньев является функцией скорости дыхания и зависит не только от мощности потока через дыхательную цепь, но и от метаболического пути, которым этот поток был вызван. Наконец, распределение эффективной силы контроля между различными ферментными реакциями находится в большой зависимости от экспериментальных условий, например от концентрации АТФ.
В заключение следует отметить, что оценка эффективной силы контроля в интактных клетках очень сложна, так как АТФ-регенерирующая система в цитозоле связана одновременно с активностью многих процессов. Поэтому простая экстраполяция результатов, полученных на изолированных митохондриях, на клеточную систему, видимо, невозможна. Трудно, например, предсказать, каковы абсолютные значения контролирующей силы адениннуклеотидтранслоказы в интактной клетке. Тем не менее попытка таких расчетов была предпринята на гепатоците. При некоторых допущениях и использовании количественных данных Акербума о содержании свободных АТФ и АДФ в гепатоцитах во время глюконеогенеза из лактата было определено, что минимальная контролирующая сила адениннуклеотидтранслоказы равна 0,34. Это значит, что в условиях, описанных Акербумом и Штаббсом, она действительно, может быть лимитирующим звеном окислительного фосфорилирования в интактных клетках.
Все это позволяет предполагать, что общие принципы контроля дыхания и окислительного фосфорилирования, установленные на модельных системах, получат свое подтверждение в условиях in vivo.