Пользовательский поиск

Дыхание изолированных гепатоцитов, сопряженное с активностью митохондриальной дыхательной цепи

Дыхание гепатоцитов является параметром, отражающим ак­тивность множественных кислородзависимых процессов. Тем не ме­нее основная его часть связана с работой митохондриальной редокс-цепи и ее энергообразующей функцией, сопряженной с энергопотребляющими процессами. Первые, как известно, локализова­ны главным образом в митохондриях, вторые — преимущественно во внемитохондриальном пространстве.

Продолжение ниже

Запасы кислорода в природе и в организме человека

... вырабатывают в 20 - 30 раз больше кислорода, чем поглощают его в процессе дыхания. Развитие растительного мира значительно обогатило земную атмосферу ... ... строго ограничены. По мере его продвижения от атмосферного воздуха к клеткам, к их энергетическим станциям, митохондриям, кислорода в организме ...

Читать дальше...

всё на эту тему


Прижизненные кинетические исследования состояния дыхатель­ной цепи с помощью полярографического метода регистрации ды­хания и оптических методов оценки редокс-состояния дыхательных переносчиков позволили установить, что в гепатоцитах, так же как и в срезах печени и перфузируемой печени, сохраняются общие за­кономерности и принципы структурной организации дыхательной цепи, установленные для изолированной полиферментной системы митохондрий.

Состав и концентрация дыхательных переносчиков в гепатоци­тах близки к тому, что показано для изолированных митохондрий.

Отношение [цитохром с + с1] / [цитохром а + а3], по Уилсону, равно 1,8 , что сравнимо с митохондриями. Однако, согласно более поздним данным Джоунса, стехиометрия между этими двумя цитохромами составляет 1:1. Содержание цитохрома b561 + b566 в гепатоцитах несколько меньше, чем цитохрома а + а3 и цитохрома с + с1, и ниже, чем показано для митохондрий печени.

Окислительная способность клеточных препаратов соответству­ет окислительной способности перфузируемой печени и изолирован­ных митохондрий, так же как и эффективность окислительного фос­форилирования: на один пункт фосфорилирования образуется один моль АТФ.

В свежевыделенных гепатоцитах с интактными плазматически­ми мембранами содержание АТФ составляет 2,5 - 5,0 мкмоль на г-1 влажного веса клеток, что весьма близко к значениям, показанным для перфузируемой пече­ни, и существенно выше, чем в срезах печени.

Отношение АТФ/АДФ в интактных изолированных гепатоци­тах, окисляющих эндогенные субстраты, равно 3-5, что также близко к значениям, полученным для печени; в отдельных случаях оно может быть значительно выше.

Следует отметить, однако, что содержание АТФ в изолирован­ных гепатоцитах коррелирует в целом с качеством выделения кле­ток и состоянием их плазматических мембран. Приведенные выше значения АТФ показаны для суспен­зии клеток, окрашиваемых трипановым синим, не более чем на 10%. В клетках с поврежденными мембранами имеет место спон­танный выход АТФ, приводящий к снижению в процессе ин­кубации ее содержания. Внутриклеточная концентрация АТФ за­висит также от среды инкубации и сопутствующих условий (оксигенации, температуры инкубации, состава инкубационных сред и субстратов окисления гормонов и пр.). При насыщении среды кислородом или введении в среду инкубации эритроцитов со­держание АТФ в клетке может увеличиться в 2 раза. Оптимальной для получения высоких значений АТФ является температура, близ­кая к физиологическим значениям (около 37°С). Ее снижение до 25°С уменьшает концентрацию АТФ в гепатоцитах в 2 раза.

Содержание адениннуклеотидов в различных препаратах печени крысы после 48ч голодания (перфузия печени и инкубация без субстратов)

Препарат

АТФ

АДф

АМФ

Сумма

Свежезамороженная печень

2,53

0,94

0,21

3,68

Перфузия печени (15мин)

2,17

0,86

0,36

3,39

Перфузия печени (85мин)

2,05

0,66

0,44

3,15

Изолированные гепатоциты (свежие)

2,57

0,87

0,35

3,90

Изолированные гепатоциты (60мин)

2,53

о’83

0,20

3,56

Срезы печени (0мин)

1,35

1,33

0,64

3,32

Срезы печени (10мин)

0,56

0,34

0,14

1,04

Срезы печени (60мин)

0,50

0,35

0,06

0,91

Динамика содержания АТФ в гепатоцитах зависит от ис­ходных его значений. В сус­пензии с высоким содержани­ем интактных гепатоцитов при начальных значениях концент­рации суммарного АТФ не менее 1 мкмоль на г-1 ткани в процессе инкубации может иметь место его увеличение, отражающее относительную стабилизацию энергетическо­го метаболизма, несмотря на то что прокрашиваемость кле­ток трипановым синим при этом может увеличиваться.

Эта закономерность, как пра­вило, отсутствует при исход­ном содержании АТФ в гепатоцитах менее 1 мкмоль на г-1. Может быть, этим в значительной степени объясняются разногласия между различными авторами по поводу ди­намики содержания АТФ в гепатоцитах при длительном их инкубировании. Согласно одним исследователям, концентрация АТФ в гепатоцитах снижается во время инкубации. Согласно другим, наоборот, после кратковременного первичного, ви­димо, адаптационного периода имеет место постепенное увеличе­ние концентрации АТФ в клетках в течение 12-24 часов инкубации.

Дыхание клеток тесно сопряжено с энергетическим метаболиз­мом. Считается, что эндогенное дыхание интактных гепатоцитов отражает главным образом энергетические траты клетки, связан­ные с синтезом белка, секреторной функцией и поддержанием ионного градиента. Все эти метаболические процессы сохра­няются на высоком уровне в изолированных гепатоцитах в течение нескольких часов. Поэтому высокое эндогенное дыхание рассматривается как показатель высокого оборота АТФ для различных синтетических реакций и активного транспорта. Динамика дыхания суспензии гепатоцитов в процессе их инкубации отражает содержание и изменение суммарной концентрации АТФ: при отно­сительно высоких исходных значениях АТФ его последующее уве­личение во времени проходит на фоне увеличения дыхания. При низкой исходной концентрации АТФ дыхание во времени уменьша­ется. То, что дыхание гепатоцитов, поддерживаемое окис­лением эндогенных субстратов, осуществляется главным образом за счет активности дыхательной цепи митохондрий, подтверждает­ся ингибиторным анализом.

Разобщители окислительного фосфорилирования увеличивают скорость эндогенного дыхания суспензии клеток на 10-60%, что, однако, существенно меньше, чем в изолирован­ных митохондриях. Этот сравнительно небольшой их эффект в кле­точных препаратах обусловлен, по-видимому, во-первых, ограниченной проницаемостью данных веществ через плазматическую мембрану и, во-вторых, высокой АТФазной активно­стью, как это было показано для срезов печени. При блоке последней стимулирующее действие разобщителей увеличивается многократно. Эффект зависит от концентрации вещест­ва, причем стимуляция дыхания может сменяться торможением. Сравнительно слабое стимулирующее дыхание действие раз­общителей было описано для срезов печени и продемон­стрировано на перфузируемой печени. Одновремен­но со специфическим действием на дыхательную функцию клеток разобщители подавляют образование в гепатоцитах лактата, глю­козы и АТФ.

В присутствии KCN (2-3мМ) — ингибитора цитохромоксидазы — цианидрезистентное дыхание интактных гепатоцитов при окислении эндогенных субстратов составляет всего 2-10%. Аналогичные результаты получены при действии антимицина. Следовательно, не менее 90% эндогенного дыхания изолированных гепатоцитов обусловлено активностью митохонд­риальной редокс-цепи. В присутствии цианида наблюдается восстановление пиридиннуклеотидов (ПНН).

Следует отметить, что в суспензии, содержащей большое коли­чество поврежденных клеток, нечувствительность эндогенного ды­хания к цианиду (цианидрезистентное дыхание) также высока. Снижение количества поврежденных гепатоцитов идет параллельно с уменьшением цианидрезистентного дыхания. На­помним, что последнее рассматривается как показатель интенсив­ности кислородзависимых процессов, не связанных с активностью основной дыхательной цепи. В связи с этим высокое цианидрезистентное дыхание следует, по-видимому, трактовать как усиление немитохондриальных кислородпотребляющих процессов в поврежденных гепатоцитах.

Вклад НАД-зависимого окисления в эндогенное дыхание гепа­тоцитов относительно невелик. Амитал — ингибитор транспорта электронов в НАД-зависимом участке дыхательной цепи — подав­ляет эндогенное дыхание клеток на 15-30% при насыщающих кон­центрациях ингибитора (3мМ). Его действие сопро­вождается восстановлением пиридиннуклеотидов, причем окисли­тельно-восстановительные превращения проходят в характерном колебательном режиме. Окисляющий эффект нараста­ет с увеличением концентрации амигала и может быть отражением усиления гликолиза и окисления НАДН в цитозольном компартменте в реакции восстановления пирувата в лактат.

Цианид, добавленный после амитала, почти полностью подав­ляет амиталнечувствительное дыхание и может незначительно вос­становить ПНН. Следовательно, слабое, ингибирую­щее дыхание действие амитала при окислении гепатоцитами эндо­генных субстратов и при сохранении высокой чувствительности дыхания к ингибитору терминального участка дыхательной цепи от­ражает поступление в дыхательную цепь потока электронов в об­ход амиталчувствительного участка. Это и понятно, так как извест­но, что в изолированных гепатоцитах эндогенное дыхание поддерживается окислением эндогенных жирных кислот.

Относительно небольшой вклад НАДН-оксидазного пути окис­ления в поддержании активности дыхательной цепи гепатоцитов, окисляющих эндогенные субстраты, отмечали и другие исследова­тели. Так, Мольдеус показал, что в присутствии ротенона концентрация АТФ в клетках уменьшается всего на 5-10%. Это не связано с каким-то нарушением электронтранспортной функции субстратного участка дыхательной цепи, так как экзогенные НАД- зависимые субстраты, несмотря на их плохую проницаемость че­рез плазматическую мембрану, не только стимулируют дыхание клеток и восстанавливают ПНН, но и увеличивают амиталчувствительное дыхание. Действие НАД-зависимых субстратов резко уменьшается на фоне ингибиторов дыхательной цепи — амитала и цианида. Следо­вательно, в изолированных гепатоцитах, окисляющих эндогенные субстраты, НАДН-оксидазный путь основной дыхательной цепи ис­пользуется ими немаксимально, но он может быть активирован эк­зогенными НАД-зависимыми субстратами.

Так как экзогенный сукцинат плохо проникает через плазмати­ческие мембраны, он слабо стимулирует дыхание суспензии с боль­шим количеством неповрежденных клеток. Коэффициент дыха­тельного контроля при окислении сукцината в этом случае равен 1,2 - 1,4. Тем не менее при этом удается зарегистрировать количе­ственно небольшое и нестабильное сравнительно с тканевыми пре­паратами восстановление ПНН, протекающее в колебательном режиме. Это может быть связано с окислением сукцината не только в поврежденных клетках, но и в интактных, так как по­казана возможность медленного проникновения очень небольшого количества экзогенного сукцината через неповрежденные плазма­тические мембраны.

В присутствии сукцината чувствительность дыхания к амиталу полностью исчезает. Более того, может иметь место даже стимуляция потребления кислорода. Характерного восстановления ПНН в этом случае также не происходит. Восстановление ПНН от сукцината, не реализуемое в при­сутствии амитала или цианида, видимо, связано с обратным переносом электронов. Таким образом, экзогенный сукцинат активирует сукцинатоксидазный путь окисления в дыхатель­ной цепи изолированных гепатоцитов.

Обращает на себя внимание также стимуляция дыхания гепа­тоцитов экзогенным НАДН, который, как и сукцинат, плохо проникает через интактную плазматическую мем­брану, а также мембрану митохондрий. В суспензии гепатоцитов с интактными мембранами (80% и более непрокрашенных клеток) увеличение скорости потребления кислорода в присутствии НАДН за счет поврежденных клеток (коэффициент дыхательного кон­троля при окислении НАДН) составляет 150-200% на протяже­нии 2ч инкубации. При этом увеличивается и чувствительность дыхания (сравнительно с эндогенным) к амиталу, особенно у свежеизолированных гепатоцитов. Если НАДН был добавлен на фон амитала, его стимулирующий дыхание эффект снижался приблизительно на 60%. Следовательно, в изолированных гепатоцитах, так же как и в срезах печени, возможно окисление некоторой части экзогенного НАДН по амиталнечувствительному пути, что может быть связано с работой челночных механизмов переноса восстановительных эквивалентов.

Таким образом, ингибиторный анализ интактных клеток позволяет оценить вклад митохондриальных и немитохондриальных кислородзависимых процессов и их соотношение, относительную мощ­ность метаболических потоков и их модификации в условиях изменения стационарного состояния.

Некоторые субстраты углеводного и жирового обмена (пируват, лактат, олеат и др.), так же как и в перфузируемой печени могут стимулировать дыхание клеток. Это связано с активацией ряда специфических для печени энергозависимых синтетических процессов — глюконеогенеза, синтеза мочевины, липогенеза. Уве­личение потребности в АТФ при инициации этих процессов усили­вает электронтранспортную функцию митохондриальной дыхатель­ной цепи и сопряженные с ней потребление кислорода и окислительное фосфорилирование, что в конечном итоге приводит к образованию АТФ, компенсирующему его расход. Эти энергопотребля­ющие процессы дают наибольший вклад в дыхательную компонен­ту клетки.

В присутствии, например, лактата, стимулирующего дыхание изолированных гепатоцитов примерно на 50% , активи­руется глюконеогенез, особенно в клетках, истощенных по глико­гену. Скорость глюконеогенеза из лактата лишь немногим меньше, чем в перфузируемой печени, но она полностью компенсируется до­бавлением лизина, который вымывается из клеток при их выделе­нии. Высокая скорость синтеза мочевины также коррелирует с высокой скоростью дыхания. Однако и в этом случае она несколько меньше, чем в перфузируемой печени, и полностью восстанавлива­ется в присутствии орнитина и лактата, также вымываемых из клетки. Длинноцепочечные жирные кислоты (олеат, пальмитат, октаноат) также являются активаторами глюконеогенеза. В их присутствии наблюдается увеличение потребления кислорода на 30-100%, сопряженное с увеличением образования АТФ. В присутствии субстратов, поддерживающих одновременно макси­мальные скорости синтеза мочевины из NH4Cl и синтеза глюкозы из лактата и орнитина, скорость потребления кислорода гепатоцитами может увеличиться до 11 мкмоль в мин-1 на г-1, что суще­ственно выше, чем в перфузируемой печени. Таким образом, высо­кие скорости дыхания в значительной степе­ни обусловлены ресинтезом АТФ.

При обеспечении максималь­ной скорости глюконеогенеза из лактата и максимальной скорости синтеза мочевины скорость образования АТФ составляет 72% от максимальной скорости образования АТФ за счет аэробного окис­ления, сопряженного с дыханием. При немаксимальной скорости окислительного фосфорилирования скорость синтеза АТФ может становиться лимитирующим звеном процесса. Следовательно, процессы дыхания, образования и расходования АТФ в специфических для клеток метаболических процессах тесно сопряжены.

Среди других АТФ-зависимых процессов в гепатоцитах наибольшее значение имеет поддержание концентрационного градиента (клетка — внешняя среда) для неорганических ионов и легко диффундируемых низкомолекулярных веществ, например аминокислот. Энергетическая потребность в активном транспорте не определена, однако известно, что в срезах печени до 40% дыхания вязано с натрий-калиевым обменом. Подтверждением этому является действие уабаина — ингибитора К-Nа-зависимой АТФазы, который подавляет дыхание изолированных гепатоцитов.

Существенная часть потребляемого клеткой кислорода может быть также связана с использованием энергии в реакциях межкомпартментного переноса Н+ и сопряженной с ней транслокацией метаболитов. Наконец, еще одна энергопотребляющая реакция в клетках печени — это синтез гликогена из глюкозы.




© Авторы и рецензенты: редакционный коллектив оздоровительного портала "На здоровье!". Все права защищены.


 
Текст сообщения*
Защита от автоматических сообщений
Загрузить изображение
 

nazdor.ru
На здоровье!
Беременность | Лечение | Энциклопедия | Статьи | Врачи и клиники | Сообщество


О проектеКарта сайта β На здоровье! © 2008—2015
nazdor.ru, nazdor.com
Контакты Наш устав

Рекомендации и мнения, опубликованные на сайте, являются справочными или популярными и предоставляются широкому кругу читателей для обсуждения. Указанная информация не заменяет квалифицированную медицинскую помощь, основанную на истории болезни и результатах диагностики. Обязательно проконсультируйтесь с врачом.

Размещенные на сайте информационные материалы, включая статьи, могут содержать информацию, предназначенную для пользователей старше 18 лет согласно Федеральному закону №436-ФЗ от 29.12.2010 года "О защите детей от информации, причиняющей вред их здоровью и развитию".