Дыхание гепатоцитов является параметром, отражающим активность множественных кислородзависимых процессов. Тем не менее основная его часть связана с работой митохондриальной редокс-цепи и ее энергообразующей функцией, сопряженной с энергопотребляющими процессами. Первые, как известно, локализованы главным образом в митохондриях, вторые — преимущественно во внемитохондриальном пространстве.
Прижизненные кинетические исследования состояния дыхательной цепи с помощью полярографического метода регистрации дыхания и оптических методов оценки редокс-состояния дыхательных переносчиков позволили установить, что в гепатоцитах, так же как и в срезах печени и перфузируемой печени, сохраняются общие закономерности и принципы структурной организации дыхательной цепи, установленные для изолированной полиферментной системы митохондрий.
Состав и концентрация дыхательных переносчиков в гепатоцитах близки к тому, что показано для изолированных митохондрий.
Отношение [цитохром с + с1] / [цитохром а + а3], по Уилсону, равно 1,8 , что сравнимо с митохондриями. Однако, согласно более поздним данным Джоунса, стехиометрия между этими двумя цитохромами составляет 1:1. Содержание цитохрома b561 + b566 в гепатоцитах несколько меньше, чем цитохрома а + а3 и цитохрома с + с1, и ниже, чем показано для митохондрий печени.
Окислительная способность клеточных препаратов соответствует окислительной способности перфузируемой печени и изолированных митохондрий, так же как и эффективность окислительного фосфорилирования: на один пункт фосфорилирования образуется один моль АТФ.
В свежевыделенных гепатоцитах с интактными плазматическими мембранами содержание АТФ составляет 2,5 - 5,0 мкмоль на г-1 влажного веса клеток, что весьма близко к значениям, показанным для перфузируемой печени, и существенно выше, чем в срезах печени.
Отношение АТФ/АДФ в интактных изолированных гепатоцитах, окисляющих эндогенные субстраты, равно 3-5, что также близко к значениям, полученным для печени; в отдельных случаях оно может быть значительно выше.
Следует отметить, однако, что содержание АТФ в изолированных гепатоцитах коррелирует в целом с качеством выделения клеток и состоянием их плазматических мембран. Приведенные выше значения АТФ показаны для суспензии клеток, окрашиваемых трипановым синим, не более чем на 10%. В клетках с поврежденными мембранами имеет место спонтанный выход АТФ, приводящий к снижению в процессе инкубации ее содержания. Внутриклеточная концентрация АТФ зависит также от среды инкубации и сопутствующих условий (оксигенации, температуры инкубации, состава инкубационных сред и субстратов окисления гормонов и пр.). При насыщении среды кислородом или введении в среду инкубации эритроцитов содержание АТФ в клетке может увеличиться в 2 раза. Оптимальной для получения высоких значений АТФ является температура, близкая к физиологическим значениям (около 37°С). Ее снижение до 25°С уменьшает концентрацию АТФ в гепатоцитах в 2 раза.
Содержание адениннуклеотидов в различных препаратах печени крысы после 48ч голодания (перфузия печени и инкубация без субстратов)
Препарат
|
АТФ
|
АДф
|
АМФ
|
Сумма
|
Свежезамороженная печень
|
2,53
|
0,94
|
0,21
|
3,68
|
Перфузия печени (15мин)
|
2,17
|
0,86
|
0,36
|
3,39
|
Перфузия печени (85мин)
|
2,05
|
0,66
|
0,44
|
3,15
|
Изолированные гепатоциты (свежие)
|
2,57
|
0,87
|
0,35
|
3,90
|
Изолированные гепатоциты (60мин)
|
2,53
|
о’83
|
0,20
|
3,56
|
Срезы печени (0мин)
|
1,35
|
1,33
|
0,64
|
3,32
|
Срезы печени (10мин)
|
0,56
|
0,34
|
0,14
|
1,04
|
Срезы печени (60мин)
|
0,50
|
0,35
|
0,06
|
0,91
|
Динамика содержания АТФ в гепатоцитах зависит от исходных его значений. В суспензии с высоким содержанием интактных гепатоцитов при начальных значениях концентрации суммарного АТФ не менее 1 мкмоль на г-1 ткани в процессе инкубации может иметь место его увеличение, отражающее относительную стабилизацию энергетического метаболизма, несмотря на то что прокрашиваемость клеток трипановым синим при этом может увеличиваться.
Эта закономерность, как правило, отсутствует при исходном содержании АТФ в гепатоцитах менее 1 мкмоль на г-1. Может быть, этим в значительной степени объясняются разногласия между различными авторами по поводу динамики содержания АТФ в гепатоцитах при длительном их инкубировании. Согласно одним исследователям, концентрация АТФ в гепатоцитах снижается во время инкубации. Согласно другим, наоборот, после кратковременного первичного, видимо, адаптационного периода имеет место постепенное увеличение концентрации АТФ в клетках в течение 12-24 часов инкубации.
Дыхание клеток тесно сопряжено с энергетическим метаболизмом. Считается, что эндогенное дыхание интактных гепатоцитов отражает главным образом энергетические траты клетки, связанные с синтезом белка, секреторной функцией и поддержанием ионного градиента. Все эти метаболические процессы сохраняются на высоком уровне в изолированных гепатоцитах в течение нескольких часов. Поэтому высокое эндогенное дыхание рассматривается как показатель высокого оборота АТФ для различных синтетических реакций и активного транспорта. Динамика дыхания суспензии гепатоцитов в процессе их инкубации отражает содержание и изменение суммарной концентрации АТФ: при относительно высоких исходных значениях АТФ его последующее увеличение во времени проходит на фоне увеличения дыхания. При низкой исходной концентрации АТФ дыхание во времени уменьшается. То, что дыхание гепатоцитов, поддерживаемое окислением эндогенных субстратов, осуществляется главным образом за счет активности дыхательной цепи митохондрий, подтверждается ингибиторным анализом.
Разобщители окислительного фосфорилирования увеличивают скорость эндогенного дыхания суспензии клеток на 10-60%, что, однако, существенно меньше, чем в изолированных митохондриях. Этот сравнительно небольшой их эффект в клеточных препаратах обусловлен, по-видимому, во-первых, ограниченной проницаемостью данных веществ через плазматическую мембрану и, во-вторых, высокой АТФазной активностью, как это было показано для срезов печени. При блоке последней стимулирующее действие разобщителей увеличивается многократно. Эффект зависит от концентрации вещества, причем стимуляция дыхания может сменяться торможением. Сравнительно слабое стимулирующее дыхание действие разобщителей было описано для срезов печени и продемонстрировано на перфузируемой печени. Одновременно со специфическим действием на дыхательную функцию клеток разобщители подавляют образование в гепатоцитах лактата, глюкозы и АТФ.
В присутствии KCN (2-3мМ) — ингибитора цитохромоксидазы — цианидрезистентное дыхание интактных гепатоцитов при окислении эндогенных субстратов составляет всего 2-10%. Аналогичные результаты получены при действии антимицина. Следовательно, не менее 90% эндогенного дыхания изолированных гепатоцитов обусловлено активностью митохондриальной редокс-цепи. В присутствии цианида наблюдается восстановление пиридиннуклеотидов (ПНН).
Следует отметить, что в суспензии, содержащей большое количество поврежденных клеток, нечувствительность эндогенного дыхания к цианиду (цианидрезистентное дыхание) также высока. Снижение количества поврежденных гепатоцитов идет параллельно с уменьшением цианидрезистентного дыхания. Напомним, что последнее рассматривается как показатель интенсивности кислородзависимых процессов, не связанных с активностью основной дыхательной цепи. В связи с этим высокое цианидрезистентное дыхание следует, по-видимому, трактовать как усиление немитохондриальных кислородпотребляющих процессов в поврежденных гепатоцитах.
Вклад НАД-зависимого окисления в эндогенное дыхание гепатоцитов относительно невелик. Амитал — ингибитор транспорта электронов в НАД-зависимом участке дыхательной цепи — подавляет эндогенное дыхание клеток на 15-30% при насыщающих концентрациях ингибитора (3мМ). Его действие сопровождается восстановлением пиридиннуклеотидов, причем окислительно-восстановительные превращения проходят в характерном колебательном режиме. Окисляющий эффект нарастает с увеличением концентрации амигала и может быть отражением усиления гликолиза и окисления НАДН в цитозольном компартменте в реакции восстановления пирувата в лактат.
Цианид, добавленный после амитала, почти полностью подавляет амиталнечувствительное дыхание и может незначительно восстановить ПНН. Следовательно, слабое, ингибирующее дыхание действие амитала при окислении гепатоцитами эндогенных субстратов и при сохранении высокой чувствительности дыхания к ингибитору терминального участка дыхательной цепи отражает поступление в дыхательную цепь потока электронов в обход амиталчувствительного участка. Это и понятно, так как известно, что в изолированных гепатоцитах эндогенное дыхание поддерживается окислением эндогенных жирных кислот.
Относительно небольшой вклад НАДН-оксидазного пути окисления в поддержании активности дыхательной цепи гепатоцитов, окисляющих эндогенные субстраты, отмечали и другие исследователи. Так, Мольдеус показал, что в присутствии ротенона концентрация АТФ в клетках уменьшается всего на 5-10%. Это не связано с каким-то нарушением электронтранспортной функции субстратного участка дыхательной цепи, так как экзогенные НАД- зависимые субстраты, несмотря на их плохую проницаемость через плазматическую мембрану, не только стимулируют дыхание клеток и восстанавливают ПНН, но и увеличивают амиталчувствительное дыхание. Действие НАД-зависимых субстратов резко уменьшается на фоне ингибиторов дыхательной цепи — амитала и цианида. Следовательно, в изолированных гепатоцитах, окисляющих эндогенные субстраты, НАДН-оксидазный путь основной дыхательной цепи используется ими немаксимально, но он может быть активирован экзогенными НАД-зависимыми субстратами.
Так как экзогенный сукцинат плохо проникает через плазматические мембраны, он слабо стимулирует дыхание суспензии с большим количеством неповрежденных клеток. Коэффициент дыхательного контроля при окислении сукцината в этом случае равен 1,2 - 1,4. Тем не менее при этом удается зарегистрировать количественно небольшое и нестабильное сравнительно с тканевыми препаратами восстановление ПНН, протекающее в колебательном режиме. Это может быть связано с окислением сукцината не только в поврежденных клетках, но и в интактных, так как показана возможность медленного проникновения очень небольшого количества экзогенного сукцината через неповрежденные плазматические мембраны.
В присутствии сукцината чувствительность дыхания к амиталу полностью исчезает. Более того, может иметь место даже стимуляция потребления кислорода. Характерного восстановления ПНН в этом случае также не происходит. Восстановление ПНН от сукцината, не реализуемое в присутствии амитала или цианида, видимо, связано с обратным переносом электронов. Таким образом, экзогенный сукцинат активирует сукцинатоксидазный путь окисления в дыхательной цепи изолированных гепатоцитов.
Обращает на себя внимание также стимуляция дыхания гепатоцитов экзогенным НАДН, который, как и сукцинат, плохо проникает через интактную плазматическую мембрану, а также мембрану митохондрий. В суспензии гепатоцитов с интактными мембранами (80% и более непрокрашенных клеток) увеличение скорости потребления кислорода в присутствии НАДН за счет поврежденных клеток (коэффициент дыхательного контроля при окислении НАДН) составляет 150-200% на протяжении 2ч инкубации. При этом увеличивается и чувствительность дыхания (сравнительно с эндогенным) к амиталу, особенно у свежеизолированных гепатоцитов. Если НАДН был добавлен на фон амитала, его стимулирующий дыхание эффект снижался приблизительно на 60%. Следовательно, в изолированных гепатоцитах, так же как и в срезах печени, возможно окисление некоторой части экзогенного НАДН по амиталнечувствительному пути, что может быть связано с работой челночных механизмов переноса восстановительных эквивалентов.
Таким образом, ингибиторный анализ интактных клеток позволяет оценить вклад митохондриальных и немитохондриальных кислородзависимых процессов и их соотношение, относительную мощность метаболических потоков и их модификации в условиях изменения стационарного состояния.
Некоторые субстраты углеводного и жирового обмена (пируват, лактат, олеат и др.), так же как и в перфузируемой печени могут стимулировать дыхание клеток. Это связано с активацией ряда специфических для печени энергозависимых синтетических процессов — глюконеогенеза, синтеза мочевины, липогенеза. Увеличение потребности в АТФ при инициации этих процессов усиливает электронтранспортную функцию митохондриальной дыхательной цепи и сопряженные с ней потребление кислорода и окислительное фосфорилирование, что в конечном итоге приводит к образованию АТФ, компенсирующему его расход. Эти энергопотребляющие процессы дают наибольший вклад в дыхательную компоненту клетки.
В присутствии, например, лактата, стимулирующего дыхание изолированных гепатоцитов примерно на 50% , активируется глюконеогенез, особенно в клетках, истощенных по гликогену. Скорость глюконеогенеза из лактата лишь немногим меньше, чем в перфузируемой печени, но она полностью компенсируется добавлением лизина, который вымывается из клеток при их выделении. Высокая скорость синтеза мочевины также коррелирует с высокой скоростью дыхания. Однако и в этом случае она несколько меньше, чем в перфузируемой печени, и полностью восстанавливается в присутствии орнитина и лактата, также вымываемых из клетки. Длинноцепочечные жирные кислоты (олеат, пальмитат, октаноат) также являются активаторами глюконеогенеза. В их присутствии наблюдается увеличение потребления кислорода на 30-100%, сопряженное с увеличением образования АТФ. В присутствии субстратов, поддерживающих одновременно максимальные скорости синтеза мочевины из NH4Cl и синтеза глюкозы из лактата и орнитина, скорость потребления кислорода гепатоцитами может увеличиться до 11 мкмоль в мин-1 на г-1, что существенно выше, чем в перфузируемой печени. Таким образом, высокие скорости дыхания в значительной степени обусловлены ресинтезом АТФ.
При обеспечении максимальной скорости глюконеогенеза из лактата и максимальной скорости синтеза мочевины скорость образования АТФ составляет 72% от максимальной скорости образования АТФ за счет аэробного окисления, сопряженного с дыханием. При немаксимальной скорости окислительного фосфорилирования скорость синтеза АТФ может становиться лимитирующим звеном процесса. Следовательно, процессы дыхания, образования и расходования АТФ в специфических для клеток метаболических процессах тесно сопряжены.
Среди других АТФ-зависимых процессов в гепатоцитах наибольшее значение имеет поддержание концентрационного градиента (клетка — внешняя среда) для неорганических ионов и легко диффундируемых низкомолекулярных веществ, например аминокислот. Энергетическая потребность в активном транспорте не определена, однако известно, что в срезах печени до 40% дыхания вязано с натрий-калиевым обменом. Подтверждением этому является действие уабаина — ингибитора К-Nа-зависимой АТФазы, который подавляет дыхание изолированных гепатоцитов.
Существенная часть потребляемого клеткой кислорода может быть также связана с использованием энергии в реакциях межкомпартментного переноса Н+ и сопряженной с ней транслокацией метаболитов. Наконец, еще одна энергопотребляющая реакция в клетках печени — это синтез гликогена из глюкозы.