Дыхание является интегральным параметром, тесно связанным с жизнедеятельностью организма. Однако до настоящего времени отсутствуют систематические исследования дыхательной функции в условиях сохранения интактности клетки, а также достаточно ясное понимание механизмов, лежащих в ее основе. Как отмечалось выше, одним из наиболее характерных признаков гепатоцитов с выраженными нарушениями плазматической мембраны является очень низкая скорость их эндогенного дыхания. Она не восстанавливается углеводами, сывороткой крови, пируватом, глутаматом, цитохромом, АТФ, вытяжкой из печени. Сахароза, экзогенный кальций, ортофосфат и АДФ оказывают тормозящее действие на дыхание таких клеток.
В противоположность этому сукцинат чрезвычайно сильно стимулирует дыхание поврежденных гепатоцитов. Это действие тем выше, чем меньше скорость эндогенного дыхания суспензии гепатоцитов, что в целом коррелирует с количеством в ней клеток с поврежденными мембранами и объясняется патологической проницаемостью сукцината в гепатоцит и благодаря этому легкой его окисляемостью в дыхательной цепи митохондрий. Аналогичная картина имеет место и при окислении экзогенного НАДН.
Эффект разобщителей, например, динитрофенола или FCCP, также больше в поврежденных клетках, чем в срезах или интактной печени, что опять-таки свидетельствует о большей доступности данных веществ к митохондриям в первом случае.
Благодаря нарушению целостности плазматической мембраны происходит выход из диспергированных клеток в экстрацеллюлярное пространство калия, пиридиннуклеотидов, АТФ, а также растворимых ферментов цитозоля, в том числе и гликолитических. Последнее является, видимо, причиной потери клетками гликолитической активности и их неспособности к окислению таких субстратов, как глюкоза, фруктоза, глицерол, сорбитол, что, в свою очередь, может приводить к дефициту ряда эндогенных субстратов окисления, например пирувата, лактата, альфаглицерофосфата, и влиять на скорость эндогенного дыхания.
В дополнение к этому показано, что в поврежденных клетках происходит резкая потеря гликогена, которая начинается уже во время перфузии печени. Этот процесс протекает на фоне активного кетогенеза и образования ацетоацетата аналогично тому, как это имеет место в печени голодных животных. Эндогенными субстратами окисления и дыхания в поврежденных гепатоцитах в этом случае являются жирные кислоты.
Нарушение селективной проницаемости клеточной мембраны способствует не только выходу веществ из клетки, но и проникновению и накоплению в ней из внеклеточной среды экзогенных субстратов и веществ в концентрациях, резко отличающихся от физиологических. Это в первую очередь касается натрия, ортофосфата и кальция. В последнем случае эффект, видимо, сходен с тем, что известно для изолированных митохондрий.
Возможность свободного, нерегулируемого поступления экзогенных веществ в клетку через поврежденную мембрану сразу же ставит ее в очень сильную зависимость от среды инкубации, что отражается и на дыхании гепатоцитов. В специально посвященном этому вопросу исследовании показано, что в зависимости от состава применяемых буферных растворов скорость эндогенного дыхания гепатоцитов может существенно различаться.
Наконец, в таких клетках имеют место, видимо, нарушения некоторых функций дыхательной цепи, так как для них наряду с другими морфологическими дефектами показано набухание внешней мембраны митохондрий. Это может быть причиной наблюдаемой плохой окисляемости некоторых экзогенных НАД- зависимых субстратов — интермедиатов ЦТК и жирных кислот, несмотря на то, что их поступление через митохондриальную мембрану в этом случае не ограничено.
Снижение скорости оборота цикла трикарбоновых кислот в гепатоцитах, полученных химико-механическими способами, показано Икстоном. Оно связано, по-видимому, с двукратным уменьшением образования в них оксалоацетата по сравнению с печенью. Это же могло влиять на редокс-потенциал клеток, величина которого более отрицательна, чем в целой печени.
Таким образом, интактность митохондрий и сохранение активности электронтранспортной функции дыхательной цепи тесно связаны с состоянием их цитоплазматического окружения.
Энзиматические способы получения гепатоцитов с использованием коллагеназы резко снизили травмирующий эффект при препаровке клетки. При этом сразу же увеличились значения эндогенного дыхания.
Из приведенных ниже сводных данных по дыханию гепатоцитов, полученных тремя способами из печени сытых животных, видно, что по мере совершенствования энзиматических способов получения изолированных клеток печени значения эндогенного дыхания (по данным разных авторов, работающих с высокоинтактными гепатоцитами, которые практически не прокрашивались трипановым синим) становятся чрезвычайно близкими (1,7-2,4 нмоль/мг-1/мин-1 при среднем значении дыхания 2,17 нмоль/мг-1 веса ткани/мин-1). Более низкие значения, получаемые до 1975-1977гг., могли быть обусловлены, во-первых, менее совершенными условиями инкубации клеток и, во-вторых, применением более низких температур выделения и инкубации (20-22°С вместо 37°С). Однако в целом, даже в ранних работах дыхание гепатоцитов, полученных энзиматическими способами, было существенно выше, чем механическими либо химическими. Оно сравнимо с дыханием перфузируемой печени и существенно выше дыхания свежеизолированных срезов.
Следует отметить, что, хотя скорость эндогенного дыхания гепатоцитов и близка к скорости дыхания перфузируемой печени, эти значения примерно в 2 раза ниже, чем в органе in situ. Эти различия связываются с необходимостью участия гормональной контроля в регуляции дыхания. Действительно, введение глюкогена либо перфузия печени свежей кровью доноров восстанавливают ее дыхание до значений интактного органа.
В интактных гепатоцитах отсутствуют специфические для поврежденных клеток эффекты, связанные с нерегулируемым поступлением в клетку различных веществ, в частности кальция и фосфата. Поэтому раствор Кребс–Рингер–фосфат не только не ингибирует дыхание, как это наблюдается в суспензии с большим количеством поврежденных гепатоцитов, но и стимулирует скорость потребления кислорода клетками. Экзогенный Са2+ активно накапливается в интактных гепатоцитах. Этот энергозависимый процесс может сопровождаться стимуляцией дыхания. Сохранение нормального уровня цитозольных ферментов, а также гликогена обеспечивает интактным гепатоцитам способность к окислению таких углеводов, как фруктоз и сорбитол. Наличие в инкубационной среде глюкозы способствует поддержанию стационарной концентрации гликогена в клетке, что свидетельствует о включении глюкозы в окислительный метаболизм.
Многие субстраты ЦТК слабо либо вообще не стимулируют дыхание интактных гепатоцитов. Однако в отличие от поврежденных клеток это обусловлено не нарушением НАД-зависимого пути окисления в дыхательной цепи, а плохой их проницаемостью через плазматическую мембрану.
Дыхание суспензии гепатоцитов мало меняется в процессе постэкстирпационной инкубации. Стабильность эндогенного дыхания во времени отражает, по-видимому, качество выделения гепатоцитов. В ранних работах, в которых использовали энзиматический способ получения гепатоцитов, последние очень быстро теряли дыхательную активность, которая могла снижаться в течение первого часа в 3 раза и более. В работах последних лет отмечается возможность получения гепатоцитов, которые сохраняют стабильное дыхание (изменения не более 20%) на протяжении нескольких часов. Стабильность дыхания суспензии гепатоцитов тесно сопряжена с содержанием в них АТФ.
Влияние внешних факторов на метаболические свойства интактных гепатоцитов резко уменьшается, в связи с чем состав инкубационных сред, а также добавление различных субстратов окисления сравнительно мало меняют скорость дыхания гепатоцитов. Однако они имеют большое значение для сохранения и поддержания метаболических свойств клеток в течение длительного времени.
Дыхание интактных гепатоцитов находится в сильной зависимости от окружающей среды и состояния организма. Скорость дыхания клеток, при выделении которых не производилась аэрация перфузата карбогеном, может быть в 2-7 раз меньше, чем при нормальной аэрации. В присутствии кислорода дыхание гепатоцитов выше, чем при насыщении инкубационных сред воздухом.
Большое влияние на дыхание оказывает температура среды; ее снижение коррелирует с уменьшением скорости потребления кислорода клетками. Показаны различия в скоростях дыхания гепатоцитов сытых и голодных животных.
Тем не менее при учете всех этих факторов и введении определенного единообразия в способы выделения и инкубации клеток, получают, как правило, чрезвычайно стабильные результаты, воспроизводимые от опыта к опыту. Это и позволяет использовать скорость эндогенного дыхания для сравнительной оценки метаболической активности гепатоцитов и интактности их плазматической мембраны.
Следует иметь в виду, что интенсивность дыхания гепатоцитов находится в достаточно сложной зависимости от их концентрации в суспензии. Эта особенность была замечена очень давно. Лоу и Стикланд, а также Говард отметили, что скорость эндогенного дыхания достигает максимальных значений при достаточно больших разведениях суспензии. После этого интенсивность потребления кислорода поддерживается относительно постоянной и на нее не влияет даже 5-кратное увеличение концентрации гепатоцитов.
Специальное экспериментальное исследование этого вопроса, проведенное нами, действительно, показало, что максимальные значения эндогенного дыхания наблюдаются в области немаксимальных концентраций клеток. Даже небольшие изменения концентрации гепатоцитов в обе стороны от этой области приводили к снижению суммарного потребления кислорода суспензией примерно на 30%. Увеличение концентрации гепатоцитов в диапазоне 0,5 - 1,2 х 106 кл/мл не влияло на скорость дыхания (область относительного плато дыхания). Различия в интенсивности дыхания между двумя крайними концентрациями этого участка не превышали 10-12%. Однако при еще более высоких концентрациях клеток (свыше 1,2 х 106 кл/мл) наблюдалось прогрессивное снижение дыхания суспензии в целом. Однозначные результаты были получены как на свежеизолированных гепатоцитах, так и через 60мин их инкубации.
Через 2ч инкубации гепатоцитов характерное усиление дыхания в области низких концентраций клеток, как правило, отсутствовало. Вместо него сразу же наблюдалось достаточно выраженное снижение дыхания суспензии гепатоцитов, нарастающее с увеличением концентрации клеток. Скорость дыхания оставалась стабильной лишь в очень узком концентрационном диапазоне. За пределами этой области обратная зависимость скорости потребления кислорода от концентрации клеток была хорошо выражена. В области стабильного дыхания для свежеизолированных и 60-минутных гепатоцитов в последнем случае она составляла не менее 30%. Таким образом, выбор оптимальной концентрации клеток при изучении дыхания гепатоцитов имеет принципиальное значение и может существенным образом повлиять на получаемые результаты.
Следует иметь в виду и еще один важный момент, связанный с расчетом скоростей дыхания изолированных клеток. При определении суммарного дыхания суспензии (с учетом общего количества гепатоцитов или их веса) выявляется линейная его зависимость от количества клеток с поврежденными плазматическими мембранами: чем она больше, тем ниже скорость потребления кислорода суспензией. Эффект одинаков в случае окисления как эндогенных субстратов, так и глюкозы.
Однако, так как гепатоциты с поврежденными мембранами имеют очень низкую скорость эндогенного дыхания, утилизация кислорода в действительности связана главным образом с дыханием жизнеспособных клеток. В суспензии с большим количеством последних (более 90%) влиянием поврежденных гепатоцитов на суммарное дыхание суспензии при расчете можно пренебречь. Но с увеличением их количества они могут вносить ощутимый вклад в дыхание. Поэтому правильнее, видимо, учитывать лишь массу реально дышащих клеток с неповрежденными мембранами. Проведенный нами такой перерасчет показывает, что дыхание неповрежденных гепатоцитов, равное примерно 2,5 нмоль О2/мг-1/мин-1 стабильно сохраняется в достаточно широком диапазоне концентраций дышащих клеток (90-30%). Однако, если в суспензии остается не более 30% неповрежденных гепатоцитов, их дыхание снижается в 2,5 раза.
Зависимость скорости дыхания гепатоцитов (нмоль О2/мг-1/мин-1) от числа прокрашенных клеток (36,5°С, рО2-воздуха)
Число непрокрашенных клеток в суспензии (%)
|
Средняя скорость эндогенного дыхания суспензии гепатоцитов
|
Расчетная скорость эндогенного дыхания жизнеспособных клеток
|
Средняя скорость дыхания суспензии клеток, окисляющих глюкозу
|
Расчетная скорость дыхания жизнеспособных клеток, окисляющих глюкозу
|
0-19
|
0,12
|
1,30
|
0.10
|
1,0
|
20-39
|
0,75
|
2,50
|
0,69
|
2,0
|
40-69
|
1,35
|
2,45
|
1,09
|
2.4
|
70-85
|
2,04
|
2,55
|
1,80
|
2,25
|
Иная картина наблюдается при оценке дыхания поврежденных клеток при окислении ими плохо проникающих через плазматическую мембрану субстратов, например сукцината или НАДН. Суммарная скорость дыхания суспензии гепатоцитов в присутствии экзогенного сукцината, несмотря на ее сложную зависимость от концентрации поврежденных клеток, в целом снижается при увеличении в суспензии количества неповрежденных клеток, что является косвенным отражением их вклада в дыхание. При наличии в суспензии не менее 80% интактных гепатоцитов суммарная скорость ее дыхания становится равной 2,2 - 2,5 нмоль О2/мг-1/мин-1, что сравнимо со скоростью эндогенного дыхания неповрежденных клеток. Коэффициент дыхательного контроля при окислении сукцината в этом случае также близок к 1,0.
Однако расчетная скорость дыхания одних только клеток, окисляющих сукцинат, показывает, что дыхание гепатоцитов с поврежденными мембранами по мере уменьшения их концентрации в суспензии увеличивается.
Аналогичные расхождения между значениями суммарного потребления кислорода суспензией гепатоцитов и величинами, получаемыми только для клеток с поврежденными мембранами, показаны и для НАДН. В этом случае также наблюдается увеличение скорости потребления кислорода гепатодитами с нарушенной селективной проницаемостью плазматических мембран по мере уменьшения их количества в суспензии, хотя динамика процесса отличается от предыдущего.
Все это свидетельствует прежде всего о том, что метаболические свойства гепатоцитов с поврежденными и неповрежденными плазматическими мембранами различны. В интактных гепатоцитах стационарные условия, позволяющие им стабилизировать дыхание, выражены лучше, чем в поврежденных.
В то же время оценка суммарного дыхания суспензии гепатоцитов, особенно в присутствии экзогенного сукцината, может быть полезна в качестве относительного показателя количества клеток в суспензии с поврежденными мембранами.