Пользовательский поиск

Дыхание как показатель функционального состояния изолированных гепатоцитов

Дыхание является интегральным параметром, тесно связанным с жизнедеятельностью организма. Однако до настоящего времени отсутствуют систематические исследования дыхательной функции в условиях сохранения интактности клетки, а также достаточно ясное понимание механизмов, лежащих в ее основе. Как отмечалось выше, одним из наиболее характерных признаков гепатоцитов с выраженными нарушениями плазматической мембраны является очень низкая скорость их эндогенного дыхания. Она не восстанавливается углеводами, сыворот­кой крови, пируватом, глутаматом, цитохромом, АТФ, вытяжкой из печени. Сахароза, экзогенный каль­ций, ортофосфат и АДФ оказывают тормозящее действие на дыха­ние таких клеток.

Продолжение ниже

Запасы кислорода в природе и в организме человека

... вырабатывают в 20 - 30 раз больше кислорода, чем поглощают его в процессе дыхания. Развитие растительного мира значительно обогатило земную атмосферу ... ... строго ограничены. По мере его продвижения от атмосферного воздуха к клеткам, к их энергетическим станциям, митохондриям, кислорода в организме ...

Читать дальше...

всё на эту тему


В противоположность этому сукцинат чрезвычайно сильно сти­мулирует дыхание поврежденных гепатоцитов. Это действие тем выше, чем меньше скорость эндогенного дыхания суспензии гепато­цитов, что в целом коррелирует с количеством в ней клеток с поврежденными мембранами и объяс­няется патологической проницаемостью сукцината в гепатоцит и благодаря этому легкой его окисляемостью в дыхательной цепи митохондрий. Аналогичная картина имеет место и при окислении экзогенного НАДН.

Эффект разобщителей, например, динитрофенола или FCCP, также больше в поврежденных клетках, чем в срезах или интакт­ной печени, что опять-таки свидетельствует о большей доступно­сти данных веществ к митохондриям в первом случае.

Благодаря нарушению целостности плазматической мембраны происходит выход из диспергированных клеток в экстрацеллюлярное пространство калия, пиридиннуклеотидов, АТФ, а также растворимых ферментов цитозоля, в том числе и гликолитических. Последнее является, видимо, причи­ной потери клетками гликолитической активности и их неспособно­сти к окислению таких субстратов, как глюкоза, фруктоза, глицерол, сорбитол, что, в свою очередь, может приводить к дефициту ряда эндогенных субстратов окисления, например пирувата, лакта­та, альфаглицерофосфата, и влиять на скорость эндогенного дыхания.

В дополнение к этому показано, что в поврежденных клетках происходит резкая потеря гликогена, которая начинает­ся уже во время перфузии печени. Этот процесс протекает на фоне активного кетогенеза и образования ацетоацетата аналогично тому, как это имеет место в печени голодных животных. Эндо­генными субстратами окисления и дыхания в поврежденных гепа­тоцитах в этом случае являются жирные кислоты.

Нарушение селективной проницаемости клеточной мембраны способствует не только выходу веществ из клетки, но и проникно­вению и накоплению в ней из внеклеточной среды экзогенных суб­стратов и веществ в концентрациях, резко отличающихся от физио­логических. Это в первую очередь касается натрия, ортофосфата и кальция. В последнем случае эффект, видимо, сходен с тем, что известно для изолированных митохондрий.

Возможность свободного, нерегулируемого поступления экзо­генных веществ в клетку через поврежденную мембрану сразу же ставит ее в очень сильную зависимость от среды инкубации, что отражается и на дыхании гепатоцитов. В специально посвященном этому вопросу исследовании показано, что в зависимости от соста­ва применяемых буферных растворов скорость эндогенного дыха­ния гепатоцитов может существенно различаться.

Наконец, в таких клетках имеют место, видимо, нарушения не­которых функций дыхательной цепи, так как для них наряду с другими морфологическими дефектами показано набухание внеш­ней мембраны митохондрий. Это может быть причиной наблюдаемой плохой окисляемости некоторых экзогенных НАД- зависимых субстратов — интермедиатов ЦТК и жирных кислот, несмотря на то, что их поступление через митохондриальную мем­брану в этом случае не ограничено.

Снижение скорости оборота цикла трикарбоновых кислот в ге­патоцитах, полученных химико-механическими способами, показа­но Икстоном. Оно связано, по-видимому, с двукратным уменьшением образования в них оксалоацетата по сравнению с пе­ченью. Это же могло влиять на редокс-потенциал клеток, величина которого более отрицательна, чем в целой печени.

Таким образом, интактность митохондрий и сохранение актив­ности электронтранспортной функции дыхательной цепи тесно свя­заны с состоянием их цитоплазматического окружения.

Энзиматические способы получения гепатоцитов с использова­нием коллагеназы резко снизили травмирующий эффект при пре­паровке клетки. При этом сразу же увеличились значения эндоген­ного дыхания.

Из приведенных ниже сводных данных по дыханию гепатоци­тов, полученных тремя способами из печени сытых животных, вид­но, что по мере совершенствования энзиматических способов по­лучения изолированных клеток печени значения эндогенного ды­хания (по данным разных авторов, работающих с высокоинтактными гепатоцитами, которые практически не прокрашивались три­пановым синим) становятся чрезвычайно близкими (1,7-2,4 нмоль/мг-1/мин-1 при среднем значении дыхания 2,17 нмоль/мг-1 веса ткани/мин-1). Более низкие значения, получаемые до 1975-1977гг., могли быть обусловлены, во-первых, менее совер­шенными условиями инкубации клеток и, во-вторых, применением более низких температур выделения и инкубации (20-22°С вместо 37°С). Однако в целом, даже в ранних работах дыхание гепатоцитов, полученных энзиматическими спо­собами, было существенно выше, чем механическими либо химическими. Оно сравнимо с дыханием перфузируемой печени и существенно выше дыхания свежеизолированных срезов.

Следует отметить, что, хотя скорость эндогенного дыхания гепатоцитов и близка к скорости дыхания перфузируемой печени, эти значения примерно в 2 раза ниже, чем в органе in situ. Эти различия связываются с необходимостью участия гормональной контроля в регуляции дыхания. Действительно, введение глюкогена либо перфузия печени свежей кровью доноров восстанавливают ее дыхание до значений интактного органа.

В интактных гепатоцитах отсутствуют специфические для пов­режденных клеток эффекты, связанные с нерегулируемым поступлением в клетку различных веществ, в частности кальция и фосфата. Поэтому раствор Кребс–Рингер–фосфат не только не ин­гибирует дыхание, как это наблюдается в суспензии с большим ко­личеством поврежденных гепатоцитов, но и стимулирует скорость потребления кислорода клетками. Экзогенный Са2+ активно накапливается в интактных гепатоцитах. Этот энергозависимый про­цесс может сопровождаться стимуляцией дыхания. Сохранение нормального уровня цитозольных ферментов, а также гликогена обеспечивает интактным гепатоцитам способность к окислению таких углеводов, как фруктоз и сорбитол. Наличие в инкубационной среде глюкозы способствует поддержанию стационарной концентрации гликогена в клетке, что свидетельствует о включении глюкозы в окислитель­ный метаболизм.

Многие субстраты ЦТК слабо либо вообще не стимулируют ды­хание интактных гепатоцитов. Однако в отличие от поврежденных клеток это обусловлено не нарушением НАД-зависимого пути окисления в дыхательной цепи, а плохой их проницаемостью через плазматическую мембрану.

Дыхание суспензии гепатоцитов мало меняется в процессе постэкстирпационной инкубации. Стабильность эндогенного дыхания во времени отражает, по-видимому, качество выделения гепатоци­тов. В ранних работах, в которых использовали энзиматический способ получения гепатоцитов, последние очень быстро теряли дыхательную активность, которая могла снижаться в течение первого часа в 3 раза и более. В работах последних лет от­мечается возможность получения гепатоцитов, которые сохраняют стабильное дыхание (изменения не более 20%) на протяжении нескольких часов. Стабильность дыхания суспен­зии гепатоцитов тесно сопряжена с содержанием в них АТФ.

Влияние внешних факторов на метаболические свойства интакт­ных гепатоцитов резко уменьшается, в связи с чем состав инкуба­ционных сред, а также добавление различных субстратов окисле­ния сравнительно мало меняют скорость дыхания гепатоцитов. Однако они имеют большое значение для сохранения и под­держания метаболических свойств клеток в течение длительного времени.

Дыхание интактных гепатоцитов находится в сильной зависимо­сти от окружающей среды и состояния организма. Скорость дыха­ния клеток, при выделении которых не производилась аэрация пер­фузата карбогеном, может быть в 2-7 раз меньше, чем при нор­мальной аэрации. В присутствии кислорода дыхание гепато­цитов выше, чем при насыщении инкубационных сред воздухом.

Большое влияние на дыхание оказывает температура среды; ее снижение коррелирует с уменьшением скорости потребления кисло­рода клетками. Показаны различия в скоростях дыха­ния гепатоцитов сытых и голодных животных.

Тем не менее при учете всех этих факторов и введении опреде­ленного единообразия в способы выделения и инкубации клеток, получают, как правило, чрезвычайно стабильные результаты, воспроизводимые от опыта к опыту. Это и позволяет использовать скорость эндогенного дыхания для сравнительной оценки метаболической активности гепатоцитов и интактности их плазматической мембраны.

Следует иметь в виду, что интенсивность дыхания гепатоцитов находится в достаточно сложной зависимости от их концентрации в суспензии. Эта особенность была замечена очень давно. Лоу и Стикланд, а также Говард отметили, что скорость эн­догенного дыхания достигает максимальных значений при доста­точно больших разведениях суспензии. После этого интенсивность потребления кислорода поддерживается относительно постоянной и на нее не влияет даже 5-кратное увеличение концентрации гепатоцитов.

Специальное экспериментальное исследование этого вопроса, проведенное нами, действительно, показало, что максимальные значения эндогенного дыхания наблюдаются в области немакси­мальных концентраций клеток. Даже небольшие изменения кон­центрации гепатоцитов в обе стороны от этой области приводили к снижению суммарного потребления кислорода суспензией при­мерно на 30%. Увеличение концентрации гепатоцитов в диапазоне 0,5 - 1,2 х 106 кл/мл не влияло на скорость дыхания (область отно­сительного плато дыхания). Различия в интенсивности дыхания между двумя крайними концентрациями этого участка не превы­шали 10-12%. Однако при еще более высоких концентрациях клеток (свыше 1,2 х 106 кл/мл) наблюдалось прогрессивное сниже­ние дыхания суспензии в целом. Однозначные результаты были получены как на свежеизолированных гепатоцитах, так и через 60мин их инкубации.

Через 2ч инкубации гепатоцитов характерное усиление дыха­ния в области низких концентраций клеток, как правило, отсутст­вовало. Вместо него сразу же наблюдалось достаточно выражен­ное снижение дыхания суспензии гепатоцитов, нарастающее с увеличением концентрации клеток. Скорость дыхания оставалась ста­бильной лишь в очень узком концентрационном диапазоне. За пре­делами этой области обратная зависимость скорости потребления кислорода от концентрации клеток была хорошо выражена. В области стабильного дыхания для свежеизолированных и 60-минут­ных гепатоцитов в последнем случае она составляла не менее 30%. Таким образом, выбор оптимальной концентрации клеток при изу­чении дыхания гепатоцитов имеет принципиальное значение и может существенным образом повлиять на получаемые резуль­таты.

Следует иметь в виду и еще один важный момент, связанный с расчетом скоростей дыхания изолированных клеток. При определении суммарного дыхания суспензии (с учетом общего количества гепатоцитов или их веса) выявляется ли­нейная его зависимость от количества клеток с поврежденными плазматическими мембранами: чем она больше, тем ниже скорость потребления кислорода суспензией. Эффект одинаков в случае окисления как эндогенных субстратов, так и глюкозы.

Однако, так как гепатоциты с поврежденными мембранами имеют очень низкую скорость эндогенного дыхания, утилизация кислорода в действительности связана главным образом с дыханием жизнеспособных клеток. В суспензии с большим количеством последних (более 90%) влиянием повреж­денных гепатоцитов на суммарное дыхание суспензии при расчете можно пренебречь. Но с увеличением их количества они могут вносить ощутимый вклад в дыхание. Поэтому правильнее, видимо, учитывать лишь массу реально дышащих клеток с неповрежденны­ми мембранами. Проведенный нами такой перерасчет показывает, что дыхание неповрежденных гепатоцитов, равное примерно 2,5 нмоль О2/мг-1/мин-1 стабильно сохраняется в достаточно ши­роком диапазоне концентраций дышащих клеток (90-30%). Од­нако, если в суспензии остается не более 30% неповрежденных ге­патоцитов, их дыхание снижается в 2,5 раза.

Зависимость скорости дыхания гепатоцитов (нмоль О2/мг-1/мин-1) от числа прокрашенных клеток (36,5°С, рО2-воздуха)

Число непрокрашенных клеток в суспензии (%)

Средняя скорость эндогенного дыха­ния суспензии гепатоцитов

Расчетная скорость эндогенного дыха­ния жизнеспособных клеток

Средняя скорость дыхания суспензии клеток, окисляющих глюкозу

Расчетная скорость дыхания жизнеспособных клеток, окисляющих глюкозу

0-19

0,12

1,30

0.10

1,0

20-39

0,75

2,50

0,69

2,0

40-69

1,35

2,45

1,09

2.4

70-85

2,04

2,55

1,80

2,25

Иная картина наблюдается при оценке дыхания поврежденных клеток при окислении ими плохо проникающих через плазматиче­скую мембрану субстратов, например сукцината или НАДН. Сум­марная скорость дыхания суспензии гепатоцитов в присутствии экзогенного сукцината, несмотря на ее сложную зависимость от концентрации поврежденных клеток, в целом снижается при увели­чении в суспензии количества неповрежденных клеток, что явля­ется косвенным отражением их вклада в дыхание. При на­личии в суспензии не менее 80% интактных гепатоцитов суммар­ная скорость ее дыхания становится равной 2,2 - 2,5 нмоль О2/мг-1/мин-1, что сравнимо со скоростью эндогенного дыхания не­поврежденных клеток. Коэффициент дыхательного контроля при окислении сукцината в этом случае также близок к 1,0.

Однако расчетная скорость дыхания одних только клеток, окис­ляющих сукцинат, показывает, что дыхание гепатоцитов с повреж­денными мембранами по мере уменьшения их концентрации в сус­пензии увеличивается.

Аналогичные расхождения между значениями суммарного по­требления кислорода суспензией гепатоцитов и величинами, полу­чаемыми только для клеток с поврежденными мембранами, пока­заны и для НАДН. В этом случае также наблюдается уве­личение скорости потребления кислорода гепатодитами с нару­шенной селективной проницаемостью плазматических мембран по мере уменьшения их количества в суспензии, хотя динамика про­цесса отличается от предыдущего.

Все это свидетельствует прежде всего о том, что метаболиче­ские свойства гепатоцитов с поврежденными и неповрежденными плазматическими мембранами различны. В интактных гепатоцитах стационарные условия, позволяющие им стабилизировать дыхание, выражены лучше, чем в поврежденных.

В то же время оценка суммарного дыхания суспензии гепато­цитов, особенно в присутствии экзогенного сукцината, может быть полезна в качестве относительного показателя количества клеток в суспензии с поврежденными мембранами.




© Авторы и рецензенты: редакционный коллектив оздоровительного портала "На здоровье!". Все права защищены.


 
Текст сообщения*
Защита от автоматических сообщений
Загрузить изображение
 

nazdor.ru
На здоровье!
Беременность | Лечение | Энциклопедия | Статьи | Врачи и клиники | Сообщество


О проектеКарта сайта β На здоровье! © 2008—2015
nazdor.ru, nazdor.com
Контакты Наш устав

Рекомендации и мнения, опубликованные на сайте, являются справочными или популярными и предоставляются широкому кругу читателей для обсуждения. Указанная информация не заменяет квалифицированную медицинскую помощь, основанную на истории болезни и результатах диагностики. Обязательно проконсультируйтесь с врачом.

Размещенные на сайте информационные материалы, включая статьи, могут содержать информацию, предназначенную для пользователей старше 18 лет согласно Федеральному закону №436-ФЗ от 29.12.2010 года "О защите детей от информации, причиняющей вред их здоровью и развитию".