В изолированных интактных гепатоцитах сохраняется метаболизм углеводов, присущий печени in vivo, что позволяет использовать количественную характеристику глюконеогенеза в качестве основного интегративного критерия метаболической интактности этих клеток.
Углеводный обмен в гепатоцитах
Способность осуществлять активный глюконеогенез сохраняется в клетках, полученных методом Берри и Фрейнда. Синтетические возможности зависят, с одной стороны, от целостности плазматической мембраны, предотвращающей потери растворимых ферментов цитоплазмы и обеспечивающей адекватный транспорт экзогенных предшественников синтеза глюкозы, а с другой — от энергообеспечивающих процессов.
Характерными признаками метаболической интактности изолированных гепатоцитов являются низкая скорость утилизации глюкозы, незначительное ее превращение в лактат и эффективный метаболизм глюкозы до СО2, а также содержание в клетках АТФ, близкое к значениям in vivo.
Первым признаком потери метаболической специфичности выделенными гепатоцитами считается их переход к «гликолитическому» типу обмена, т.е. обеспечению энергетических и синтетических потребностей исключительно за счет окисления глюкозы и других углеводов. Эти первичные сдвиги углеводного обмена совпадают по времени с изменениями других специфических функций гепатоцитов, например с активностью ферментов, участвующих в лекарственном метаболизме и содержащих цитохром Р-450.
Свежеизолированные клетки печени сохраняют интенсивность метаболизма, близкую к величинам в перфузируемой печени. Однако количественные характеристики, отражающие углеводный обмен гепатоцитов, в значительной степени зависят от условий инкубации, содержания экзогенных субстратов и функционального состояния клеток.
Гепатоциты, выделенные из печени голодных крыс, при высокой степени интактности плазматических мембран обладают высокой активностью глюконеогенеза на протяжении 3ч инкубации в среде с лактатом (10мМ). Клетки, выделенные из печени сытых крыс, секретируют глюкозу в инкубационную среду со скоростью 0,15 мкмоль в мин-1 на г-1 влажного веса. Клетки из печени голодавших крыс поглощают глюкозу из среды со скоростью 0,03 мкмоль в мин-1 на г-1 влажного веса. Все это говорит об интактности регуляторных механизмов, контролирующих углеводный обмен изолированных гепатоцитов.
Поглощение глюкозы гепатоцитами
Исследования функции гепатоцитов in vitro свидетельствуют об ограниченной способности клеток поглощать глюкозу при физиологических ее концентрациях, а также образовывать гликоген.
При концентрации глюкозы 20мМ, что несколько превосходит обычное ее содержание в портальной вене, скорость глюконеогенеза из предшественников была несравнимо больше скорости синтеза гликогена из экзогенной глюкозы. Аналогичные результаты были получены на печени, перфузируемой глюкозой (30мМ).
Перенос глюкозы через плазматическую мембрану в гепатоциты к месту метаболических превращений — энергонезависимый процесс, не контролирующий скорость ее утилизации.
Способность изолированных клеток печени поглощать глюкозу из среды инкубации определяется интенсивностью ферментных процессов, ответственных за фосфорилирование и дефосфорилирование глюкозы. Эти процессы катализируются глюкокиназой (гексокиназой) и глюкозо-6-фосфатазой. Считается, что глюкокиназа с высоким показателем К играет ведущую роль в фосфорилировании глюкозы. Однако регуляторная роль глюкокиназы в фосфорилировании глюкозы печени была подвергнута сомнению. Экспериментальные факты свидетельствовали о способности глюкозо-6-фосфатазы катализировать обратную реакцию и фосфорилировать глюкозу, используя в качестве основного источника фосфата пирофосфат. Эти данные легли в основу гипотезы о фосфорилировании глюкозы в глюкозо-6-фосфатазной реакции в условиях малой активности глюкокиназы.
Бонтемпс с соавторами получили доказательства, опровергшие сложившиеся мнения. Обнаружено, что утилизация глюкозы печенью быстро инактивируется ингибитором глюкокиназы — М-ацетилглюкозоамином. Глюкозо-6-фосфатаза не ингибируется этим препаратом.
К аналогичному выводу об отсутствии фосфорилирующей активности глюкозо-6-фосфатазы в интактной клетке пришли Катц с соавторами. Они показали, что скорость образования глюкозо-6-фосфата максимальна при высокой активности глюкокиназы, а глюкозо-6-фосфотазы — при низкой. Такая ситуация возникает в клетках печени крыс, получавших питание после суточного голодания. Авторы использовали метод регистрации скорости образования глюкозо-6-фосфата, не зависящий от природы фермента, механизма реакции и фосфатного донора.
Процесс фосфорилирования глюкозы изолированными гепатоцитами не контролируется гексокиназой, так как этот фермент локализован исключительно в непаренхиматозных клетках печени.
Фосфорилирование глюкозы зависит только от концентрации ее в среде и не зависит от интенсивности глюконеогенеза или синтеза гликогена. Максимальная скорость глюкокиназной реакции при инкубации гепатоцитов сытых крыс с 10мМ глюкозой составляла 2,6 - 3,1 мкмоль в мин-1 на г-1 влажного веса печени.
Следует отметить высокую чувствительность глюкокиназы изолированных гепатоцитов к ионам калия, присутствие которых приводит к 4-кратному возрастанию скорости поглощения глюкозы и увеличению в 2 раза внутриклеточного содержания глюкозо-6-фосфата.
Все изложенное позволяет рассматривать глюкокиназу изолированных гепатоцитов как основное регулирующее звено процесса поглощения глюкозы из среды и управлять этим процессом, используя различные концентрации глюкозы в инкубационной среде.