Способность изолированных клеток печени синтезировать триглицериды и экскретировать их в составе ЛОНП мало зависит от степени повреждения плазматических мембран и сохраняется у свежеизолированных гепатоцитов и в культуре.
На сегодняшний день до конца не выяснены механизмы, обеспечивающие регуляцию синтеза и секреции триглицеридов клетками печени. Однако известно, что неэстерифицированные жирные кислоты стимулируют синтез триглицеридов, апопротеидов ЛОНП и секрецию ЛОНП in vivo, и что эта функция сохраняется в суспензии изолированных гепатоцитов. Но апопротеиды ЛОНП, секретируемые гепатоцитами, представлены в основном В и Е-типами, в то время как печень крысы секретирует в кровь ЛОНП с апопротеидом типа С.
Регуляция синтеза триглицеридов клетками печени в целом организме связана в первую очередь с изменением активности глицеролфосфатацилтрансферазы и фосфатидатфосфогидролазы, так как необходимые количества субстратов обеспечиваются поступлениями из других органов. В изолированных клетках печени липогенез может лимитироваться доступностью свободных жирных кислот и глицерол-3-фосфата.
Возрастающие концентрации экзогенной пальмитиновой кислоты вплоть до 1,6мМ в суспензии свежевыделенных гепатоцитов вызывали линейное увеличение скорости синтеза триглицеридов и секреции ЛОНП в среду на протяжении трехчасового периода инкубации. Параллельно стимулировалась активность ферментов, ответственных за синтез триглицеридов. Такой же эффект вызывала олеиновая кислота при увеличении содержания до 2,0мМ. При концентрации 3 и 4мМ скорость включения олеата в состав триглицеридов резко снижалась.
Тот факт, что регуляция метаболических превращений нейтральных липидов за счет доступности субстратов может нивелировать контролирующие изменения активностей ферментов позволяет нам опустить рассмотрение ферментативной регуляции и уделить основное внимание роли глицерол-3-фосфата в синтезе триглицеридов при использовании изолированных клеток печени.
Инкубация гепатоцитов в течение 90 минут в среде Кребса-Рингера с 2,6%-ным обезжиренным альбумином без каких-либо субстратов вызывала снижение содержания глицерол-3-фосфата в 3-10 раз в зависимости от функционального состояния животного по сравнению с интактной печенью. Концентрация метаболита составляла 0,10 и 0,05мкмоль на г-1 влажного веса клеток сытых и голодных крыс соответственно. Измерение содержания этого соединения в быстрозамороженных образцах интактной печени составляло 0,3 и 0,44 мкмоль на г-1 печени сытых и голодных крыс соответственно. Низкие концентрации глицерол-3-фосфата в значительной степей ограничивали синтез триглицеридов из меченого пальмитата.
Внесение в среду инкубации некоторых предшественников, а именно лактата (5мМ) с пируватом (0,5мМ) или глюкозы (20мМ), очень быстро (за 10-20 минут инкубации клеток) способствовало повышению содержания глицерол-3-фосфата до величин, даже несколько превышающих значение для интактной печени. При таких концентрациях скорость синтеза липидов достигала максимальных величин. Эти данные совпадают с наблюдением, что добавление 20мМ глюкозы к среде в начале инкубации увеличивает скорость синтеза триглицеридов в гепатоцитах от голодных крыс до уровня, найденного в гепатоцитах сытых животных.
Добавление в инкубационную среду глицерола в качестве предшественника способствовало увеличению содержания в гепатоцитах глицерол-3-фосфата и выравниванию различий между скоростями синтеза триглицеридов в гепатоцитах животных в различных функциональных состояниях.
Представленные результаты свидетельствуют о дефиците глицерол-3-фосфата в свежеизолированных клетках, инкубируемых без субстратов, и подтверждают предположение о регуляторной роли доступности субстратов при синтезе липидов в таких условиях.
Необходимый компонент сред выделения и инкубации — альбумин — небезразличен для функции изолированных клеток. При культивировании гепатоцитов в среде, содержащей альбумин в концентрации, соответствующей плазме крови, секреция ЛОНП, синтез триглицеридов и апопротеида В снижались на 50-90%. Эффект был связан с концентрацией альбумина и не зависел от осмомолярности раствора.
Факт уменьшения концентрации сывороточного альбумина, сопровождаемого увеличением концентрации ЛОНП, подтверждает, что при создании адекватных условий для жизнедеятельности изолированных гепатоцитов необходимо использовать физиологические концентрации альбумина, предотвращающие избыточную секрецию ЛОНП.
При создании инкубационной среды, в составе которой предполагается присутствие субстратов липидной природы, также необходимо вводить альбумин. При внесении этих компонентов обязательно учитываются допустимые концентрации липидных субстратов, рекомендуемые количества альбумина и их соотношение.
В плазме крысы концентрация альбуминов достигает 3,3% (вес/объем), и у сытых животных молярное отношение жирных кислот к альбумину составляет 0,6 - 0,7. Однако в экспериментальной работе используются соотношения 0,34 и 7,1. Такие колебания отнюдь не обусловлены произвольным выбором авторов, а диктуются условиями, обоснованными экспериментально, которые обеспечивают оптимальные кинетические характеристики изучаемых процессов. При использовании в инкубационной среде пальмитата в молярном соотношении 0,34 к альбумину, 19мкМ малонил-КоА вызывало 50%-ное ингибирование скорости окисления жирной кислоты изолированными гепатоцитами. Такой же эффект вызывал малонил-КоА в состоянии in vivo. Но когда соотношение пальмитиновой кислоты к альбумину возрастало до 1 интенсивность ингибирующего эффекта снижалась, а при соотношении 3,5 исчезала. Необходимо также помнить, что отношение жирная кислота/альбумин постепенно изменяется в процессе инкубации, так как клетки утилизируют жирные кислоты.
