Функциональная полноценность печени, связанная с белковым обменом, предполагает участие гепатоцитов в синтезе собственных внутриклеточных белков и белков плазмы.
В интактной печени существует определенное равновесие между скоростями синтеза и распада белка. Свежеизолированные гепатоциты, как показывает анализ динамики содержания аминокислот в инкубационной среде, находятся в состоянии отрицательного азотистого баланса. Нарушение азотистого баланса может быть вызвано сдвигом равновесия между скоростями утилизации и образования аминокислот. Предрасполагающими факторами смещения равновесия между анаболическим и катаболическим направлениями белкового обмена в изолированных гепатоцитах являются отсутствие естественных источников экзогенных аминокислот и изменение функциональной полноценности клеток в процессе выделения.
Первые попытки Сеглена оценить в изолированных гепатоцитах интенсивность биосинтеза белка по включению меченых аминокислот привели к получению только ориентировочных данных из-за высокой гетерогенности аминокислот по скорости включения в белок и утилизации в других метаболических процессах. Кроме того, NH4Cl, использованный автором в качестве ингибитора белковой деградации, оказывал угнетающее действие и на белковый синтез. Это свойство маскировало истинную скорость включения метки в белок.
Для снижения интенсивности деградации белка в дальнейших исследованиях Сеглен использовал метиламин и лейпептин, которые не затрагивали биосинтетические процессы. Исключение влияния процессов катаболизма аминокислот достигалось использованием единственного предшественника — (14Сl)-валина, утилизация которого в окислительном метаболизме печени происходила с очень низкой скоростью. Создав в инкубационной среде высокую его концентрацию (5-10мМ), удалось снизить разбавление метки продуктами протеолиза. При инкубации изолированных гепатоцитов в таких условиях и без физиологической смеси аминокислот метка начинала включаться в белок только через 10-20 минут и синтез шел линейно в течение 60 минут со скоростью 0,3-0,5% в час. Это в 10 раз ниже скорости деградации в аналогичных условиях и в 4-6 раз — в условиях сбалансированного белкового обмена in vivo.
Таким образом, свежеизолированные гепатоциты в течение первых нескольких часов характеризуются отрицательным азотистым балансом за счет снижения анаболических процессов и преобладания катаболических. Но это не приводит к необратимым изменениям в их метаболизме, и гепатоциты сохраняют способность увеличивать скорость синтеза белка при добавлении в инкубационную среду экзогенных аминокислот в возрастающих концентрациях.
Увеличение концентрации аминокислот в инкубационной среде в 10 раз по сравнению с физиологическими значениями приводило к стимуляции биосинтеза в 1,5 раза. Отставание синтеза от интенсивности деградации в этих условиях не связано с доступностью экзогенных аминокислот внутриклеточным анаболическим процессам, так как и в случае интактных плазматических мембран, и при нарушении их целостности, 80% меченых аминокислот уже через 2 минуты инкубации проникает внутрь клеток. Гепатоциты должны иметь достаточное количество эндогенных аминокислот за счет 10-кратного преобладания катаболизма над анаболизмом, тем более что они постоянно выделяют избыток аминокислот в среду.
Возникает вопрос: почему добавление экзогенных аминокислот вызывает стимуляцию синтеза белка в условиях постоянного поступления эндогенного пластического материала и почему эта стимуляция не достигает величин, свойственных in vivo, когда в клетках имеются потенциальные возможности для этого.
Пути реализации стимулирующего эффекта экзогенных аминокислот могут обеспечиваться несколькими механизмами. Преинкубация гепатоцитов в смеси аминокислот предотвращает экскрецию эндогенных аминокислот, что может способствовать более полному использованию эндогенных аминокислот метаболическими системами клеток. Не исключена возможность использования экзогенных аминокислот в качестве дополнительного источника энергии. В пользу этого свидетельствуют данные о том, что стимулирующий эффект экзогенных аминокислот угнетается аминооксиацетатом — ингибитором аминотрансферазы — и обращается действием субстратов энергетического обмена, таких, как лактат и пируват. Если гепатоциты выделяются без субстратов, то начало включения меченых аминокислот в белок регистрируется только через некоторое время после интенсификации деградации белка. Скорость синтеза белка, регистрируемая по включению меченого валина, медленно нарастает во времени пропорционально увеличению концентрации аминокислот в результате деградации белка. Предварительная инкубация клеток в течение 30 минут со смесью аминокислот в соотношении, близком к физиологическому, способствует быстрому включению метки в белок сразу после внесения валина в инкубационную среду. Из этого следует, что синтез белка в гепатоцитах не начинается, вероятно, до тех пор, пока концентрация внутриклеточного пула аминокислот не достигает необходимого уровня.
Использование инкубационных сред с аминокислотами в концентрациях, близких к физиологическим, а также превышающих их в 10 раз, способствовало возрастанию скорости синтеза белка в гепатоцитах соответственно на 15-20% и в 1,5 раза по сравнению со скоростями синтеза при инкубации без аминокислот. Высокие концентрации аминокислот не безразличны для функции гепатоцитов. Большинство сбалансированных сред, используемых для инкубации гепатоцитов, содержат аминокислоты в концентрации, в 3 раза превышающей содержание в плазме крысы через 3 часа после приема пищи.
Описанные особенности стимуляции белкового синтеза в изолированных клетках экзогенными аминокислотами свидетельствуют, что их количество, вероятно, является важным, но не определяющим фактором в регуляции скорости анаболизма, так как интенсивность процесса не достигает физиологических величин.