Пользовательский поиск

Инкубирование изолированных гепатоцитов

Условия инкубирования очищенной и отмытой суспензии гепа­тоцитов непрерывно совершенствуются. Тем не менее к настоящему времени сложился ряд общих приемов, обеспечивающих в течение достаточно длительного времени (не менее 2ч) сохранение метаболических свойств гепатоцитов на сравнительно высоком уровне. Они сводятся к подбору адекватных сред инкубации, условий оксигенации, температурного режима и техники инкубирования.

Продолжение ниже

Эффективность лучших препаратов для похудения

... году его продажа на рынке была ограничена, потому что более глубокие исследования показали увеличение риска возникновения серьезных осложнений ... ... безопасности Орлистата в связи с сообщениями о серьезных нарушениях функций печени у небольшого количества людей, принимающих его. Взаимосвязи между ...

Читать дальше...

всё на эту тему


Состав сред инкубации подбирается в соответствии с теми же соображениями, что и для перфузии и диспергирования. В качестве основы используются стандартные солевые среды. Напомним, что не рекомендуется применять фосфатный буфер, хотя неорганический фосфат включается в со­став сред инкубации.

Сохранение функционально-метаболических свойств изолиро­ванных клеток в процессе инкубации является предметом особого внимания исследователей. Накопленный опыт свидетельствует, что плазматическая мембрана гепатоцитов, использующих эндогенные субстраты, сохраняется интактной в течение 1-2 часов инкубации в минимально сбалансированных солевых буферных средах. Внутриклеточное содержание АТФ в этих условиях снижается довольно медленно. В то же время показано, что для сохранения специфических функций гепатоцитов в течение длительного времени (3-6ч) в среду необходимо вводить дополнительные компоненты.

Ряд лабораторий, получающих интактные и метаболически активные гепатоциты, используют различные варианты сред, содержащих некоторые углеводные субстраты, аминокислоты, гормоны и антибиотики. В качестве основы часто применяется субстратсодержащая среда Уаймауфа. Использование субстратов в инкубационной среде определяется прежде всего кругом научных задач, которые решаются в данных экспериментальных условиях.

Так, например, чтобы затормозить распад гликогена и подавить активность глюконеогенеза в истощенных по субстратам гепатоцитах, к средам инкубации добавляют глюкозу. При необходимости активации глюконеогенеза, наоборот, желательно включение в со­став сред лактата, пирувата, а также жирных кислот (например, олеата), но не субстратов ЦТК. Для ини­циации синтеза мочевины требуется NH4Cl в сочетании с жирными кислотами и т.д.

Не рекомендуется включать в среды инкубации интермедиаты ЦТК, так как показана быстрая потеря жизнеспособности клеток в их присутствии. Выраженное отрицательное влияние на жиз­неспособность клеток имеет сукцинат, хотя в присутствии различ­ных других субстратов его действие может несколько меняться.

Поиск адекватных сред для поддержания в течение длительного времени жизнеспособности изолированных гепатоцитов, сохранения в них белкового синтеза, энергетического статуса и специфических метаболических процессов является самостоятельной проблемой. Эти вопросы будут рассмотрены в последующих разделах.

В период инкубации изолированных гепатоцитов сохраняются требования к высокой буферной емкости сред, начальное pH кото­рых, учитывая их быстрое закисление в присутствии метаболизирующих клеток, задается равным 7,6-7,5. Для повышения буферной емкости среды инкубации, используемой для продолжительно­го хранения клеток (более 1ч), рекомендуется в сбалансированную солевую среду вводить органический буфер типа ГЕПЕС (20-40мМ). В качестве основного по-прежнему используют бикарбонатный буфер в связи с тем, что в клетках печени существует несколько метаболических систем, использующих карбонат в биосинтетических целях. Причем при их интенсификации эндогенных его количеств недостаточно и возникает необходимость добавления в инкубационную среду экзогенного НСО3.

Включение заменителей плазмы крови в состав инкубационных сред, по-видимому, обязательно. Наиболее часто для этих целей используют альбумин. В его отсутствии происходит быстрая агрега­ция клеток. Добавление альбумина обеспечивает более высокий уровень дыхания гепатоцитов. Он стабилизирует клеточную мембрану, создает необходимое осмотическое давление, предохранит мембранные белки. Альбумин связывает также жирные кислоты и билирубин, высокие концентрации которых токсичны для клеток. Поэтому его присутствие в инкубационной среде жела­тельно, чтобы исключить побочные токсические эффекты. Кроме того, присутствие альбумина в среде инкубации предотвращает из­быточную секрецию гепатоцитами в окружающую среду липопротеидных комплексов очень низкой плотности и тем самым снижает чрезмерную биосинтетическую активность изолированных клеток, приближая ее к состоянию in vivo.

В литературе приводятся данные о применении самых различных концентраций альбумина для сред инкубации: от 0,1 до 4%. Опыт работы показывает, что наилучшие резуль­таты достигаются при использовании 1%-ного раствора альбумина. Альбумин исключается из состава сред инкубации в специальных случаях, например при изучении окисления жирных кислот или кетогенеза в гепатоцитах.

Имеются сообщения об использовании вместо альбумина желатина. Тем не менее в ряде исследований, в которых были получены гепатоциты с хорошими метаболическими показателями, ни альбумин, ни его заменители не применялись.

Попытка добавления в инкубационную среду сыворотки крови была сделана очень давно. При этом было показано, что гепатоциты, помещенные в среду, содержащую сыворотку лошади, крайне быстро (в течение нескольких минут) агглютинируют, если эту сы­воротку не подвергнуть предварительной термообработке при 58°С. Этого не наблюдается при использовании сыворотки цыпленка, хотя в присутствии последней появляются некоторые нетипичные для клеток печени метаболиты.

В 100%-ной сыворотке крыс гепатоциты дышат в 2 раза интен­сивнее, чем в растворе Хенкса. Стимулирующий агрегацию эффект сыворотки связывают с ее ролью в образовании клеточных контактов, которые, как известно, не формируются в погибающих клетках.

Добавление сыворотки цыпленка к среде, в которой инку­бировались изолированные гепатоциты, стабилизировало внутри­клеточный уровень АТФ на протяжении многих часов, снижало потери белка, подавляло аутолиз клеток, обеспечивало в течение длительного времени высокий стационарный уровень синтеза бел­ков. Сыворотка стабилизировала плазматическую мембрану, благодаря чему отсутствовала потеря ферментов цитозоля во времени и поддерживались высокие значения потенциала К+. Наряду с этим она увеличивала чувствительность глюконеогенеза в изолирован­ных гепатоцитах к глюкагону и инсулину, т.е. положительно дей­ствовала на гормональную рецепцию клетки. Так как все эти свойства сыворотки сохранялись после диализа, предполагается, что стабилизирующим фактором является высокомолекулярный ее компонент, прочно связанный с сывороточными белками.

Несмотря на все эти свидетельства о положительном влиянии сыворотки на жизнеспособность изолированных гепатоцитов, во­прос о необходимости ее использования на этапе инкубации клеток остается открытым.

Условия оксигенации при инкубации изолированных гепатоцитов являются принципиальным моментом, от которого зависит в значительной степени длительность сохранения жизнеспособности клеток и их метаболических свойств. Клетки, инкубированные в средах, насыщенных по воздуху, быстро теряют АТФ. Поэто­му в методических руководствах по выделению гепатоцитов реко­мендуется насыщать инкубационные среды кислородом.

Инкубацию гепатоцитов, как правило, проводят в среде, насы­щенной карбогеном. Колбы с суспензией аэрируют газовой смесью и закрывают парафилмом. Не следует допускать появления воздушных пузырей в инкубационной суспензии, так как это ведет к повреждению клеток при испарении раствора.

До самого последнего времени существуют противоречивые мне­ния относительно оптимального температурного режима инкубации суспензии гепатоцитов.

В ранних работах практиковалось хранение суспензии гепато­цитов при низких (+2°) температурах. По данным Кребса, если толщина суспензионного слоя не превышает 2см, в этих ус­ловиях в течение 4ч сохраняется постоянным pH и оксигенация адекватна без шейкирования.

Тем не менее в подавляющем большинстве работ при инкубации клеток используется температура 37° и только в специальных слу­чаях, например при изучении транспорта ионов, — температура, близкая к нулю. Это связано с тем, что переход от низких темпера­тур к физиологическим и, наоборот, не безразличен для клетки, так как плазматические мембраны и внутриклеточные мембранные об­разования чувствительны не только к замораживанию, но и к ох­лаждению. Показано, что основным криоповреждающим фактором при охлаждении являются ослабление гидрофобных взаимодейст­вий в мембранах и внутриклеточная гипоксия, наступающая вслед­ствие замедления процессов внутриклеточного транспорта. Гипоксия может опосредованно привести к развитию ряда патоло­гических процессов в клетке, в том числе к активации перекисного окисления липидов с последующим повреждением лизосомальных мембран, изменению ионного состава гиалоплазмы и т.д.

Кроме того, хорошо известны изменения ионного состава клетки при низких температурах, выражающиеся в обращении потока ионов (увеличение в клетке при 0° содержания натрия и кальция и снижение содержания калия). Это состояние сходно с анаэробным шоком. Оно носит обратимый характер, если время экспозиции на холоде не превышает 1-2ч, после чего начи­нается развитие аутолитических процессов.

После очистки и отмывки первичной суспензии гепатоцитов по­лучают конечную суспензию, объем которой доводят до 70-100мл с таким расчетом, чтобы получить оптимальную концентрацию 1,0 - 3,0х106 клеток/мл. Такая суспензия удобна для дальнейших био­физических и биохимических исследований. В коротких эксперимен­тах клетки инкубируют в стеклянных сосудах небольших объемов 25 см3 типа колб Эрленмейера, которые силиконизируют для снижения агрегации клеток на поверхности стекла. Цилиндрические сосуды неудобны из-за сильного испарения в них инкубационной жидкости. Оптимальное соотношение объема суспензии клеток к объему колбы приблизительно равно 1:10.

Для улучшения оксигенации и предотвращения быстрой реагре­гации гепатоцитов необходимо достаточно интенсивное перемеши­вание суспензии. Это лучше всего делать на ротерном шейкере при частоте 70-150 колебаний/мин. Наклон оси колбы к поверхности клеточной суспензии и инкубационной среде составляет 45-60°. При длительном инкубировании гепатоцитов (более 2 часов) необходи­мо более мягкое перемешивание во избежание механического по­вреждения клеток и сохранения их структурной интактности. Час­тота перемешивания не должна превышать тогда 20-30 колебаний/мин. Клетки с неповрежденными мембранами при пра­вильно подобранных условиях инкубации можно использовать в течение длительного времени (до 8ч). Через 2-3 часа после начала инкубации вначале небольшие клеточные агрегаты могут формиро­вать крупные образования в виде тяжей.

Согласно нашим данным, для предотвращения ранней реагрега­ции клеток целесообразно вносить в среду инкубации Са2+ в кон­центрации 0,5-1мМ. Дивалентные ионы оказывают регулирующее действие на адгезионные свойства гепатоцитов.

Если в процессе инкубации не произошло повреждения плазма­тической мембраны гепатоцитов, мелкие (до 10-20 клеток) агрега­ты легко разбиваются при фильтровании. При этом правильная, характерная для интактных клеток форма сохраняется. При необратимых повреждениях мембраны интенсивная реагрегация клеток и образование тяжей наблюдаются уже к концу первого часа инку­бации. Число клеток в агрегате может достигать нескольких десят­ков тысяч. Перемешивание или фильтрация такого сгустка не обеспечивают дезагрегацию: тяжи остаются на фильтре. Скорость реагрегации увеличивается примерно вдвое с ростом температуры инкубации от 22 до 37°С.

Описание особенностей и рекомендации для работы с изолиро­ванными клетками печени, хотя и включают в себя наиболее при­знанные и отработанные приемы, тем не менее не всегда обязатель­ны. Так, в самое последнее время вместо описанного способа инкубации клеток была применена иммобилизация гепатоцитов в геле. Это открывает дополнительные возможности, основанные на применении несложной техники многоканальной перфузии. Главная трудность при этом состоит в сохранении интактности гепатоцитов при непрерывном смывании клеток в геле сефадекса. Преимуществом же этого способа является то, что инкубация позволяла поддерживать необходимый уровень субстратов и продуктов метаболизма постоянными. При многоканальной перфузии появляется возможность (используя иммобилизованные ферменты или гормоны) изучать действие нескольких факторов на одном и том же клеточном препарате.




© Авторы и рецензенты: редакционный коллектив оздоровительного портала "На здоровье!". Все права защищены.


 
Текст сообщения*
Защита от автоматических сообщений
Загрузить изображение
 

nazdor.ru
На здоровье!
Беременность | Лечение | Энциклопедия | Статьи | Врачи и клиники | Сообщество


О проектеКарта сайта β На здоровье! © 2008—2015
nazdor.ru, nazdor.com
Контакты Наш устав

Рекомендации и мнения, опубликованные на сайте, являются справочными или популярными и предоставляются широкому кругу читателей для обсуждения. Указанная информация не заменяет квалифицированную медицинскую помощь, основанную на истории болезни и результатах диагностики. Обязательно проконсультируйтесь с врачом.

Размещенные на сайте информационные материалы, включая статьи, могут содержать информацию, предназначенную для пользователей старше 18 лет согласно Федеральному закону №436-ФЗ от 29.12.2010 года "О защите детей от информации, причиняющей вред их здоровью и развитию".