Пользовательский поиск

Оптимизация условий диспергирования печени

Для получения суспензии жизнеспособных гепатоцитов необхо­дим правильный подбор диспергирующих условий, одним из ко­торых является декальцинация. Удаление ио­нов кальция на первом этапе перфузии является существенным ус­ловием успешного диспергирования ткани печени. По данным Сеглена, замена раствора Рингера на среду Хенкса без кальция в этот период увеличивает выход клеток более чем в 5 раз.

Продолжение ниже

Глюкозамин - биохимия и влияние на здоровье

... пациенты часто начинают превышать рекомендуемые дозировки. Предварительно показано, что в таких дозировках глюкозамин может повреждать клетки печени и повышать риск развития диабета. Побочные эффекты, которые обычно незначительны и редки, включают расстройство желудка, запор , ...

Читать дальше...

всё на эту тему


Очень часто для более полного удаления ионов кальция из кле­ток в состав среды первого этапа перфузии включают хелатор кальция ЭГТА. Согласно некоторым опытам ЭГТА, если и не увеличи­вает выход клеток при прочих оптимальных условиях их выделения, то по крайней мере заметно снижает механические усилия, применяемые при диспергировании ткани.

Эффект вымывания кальция необратимо связан, видимо, с некоторыми конформационными изменениями во внеклеточном матриксе, которым способствует удаление «фактора адгезии клеток»: в отсутствии последнего улучшается дисперсия ткани. Ми­нимальная концентрация кальция в перфузате, способная подавить диспергирование, не определена, но, видимо, очень низка. Дисперсию могут ингибировать даже те следовые количества кальция, которые высвобождаются из ткани в перфузат. Это действие оказывают любые концентрации экзогенного кальция.

На втором этапе перфузии введение в среду, содержащую коллагеназу, ионов кальция, необходимых для активации фермента, не сказывается восстанавливающим образом на состоянии меж­клеточных контактов и не приводит к обращению эффекта от пер­фузии бескальциевым солевым раствором. В то же время добавление кальция в этот период (оно не должно быть слишком ранним) благотворно влияет на состояние плазматической мембраны и тем самым на метаболические свойства выделенных гепатоцитов. Концентрация кальция в используемых средах колеблется от 0,5 до 5мМ. Наиболее часто применяют раствор, содержащий 1-2мМ кальция. В больших концентрациях (больше 6мМ) кальций ин­гибирует набухание печени.

Действие кальция ионспецифично. Сеглен указывает, что маг­ниевые соли оказывают ингибирующее действие на процесс набу­хания печени, если они введены в отсутствие кальция. При одно­временном применении кальция и магния ингибирующее действие не наблюдается. Многие авторы включают поэтому магний в состав среды перфузата.

Следует учитывать, однако, что отсутствие кальция в среде вы­деления и хелатирующие агенты могут давать побочные эффекты, сказывающиеся на метаболизме гепатоцита. Так, например, отсут­ствие Са2+ в среде изоляции вдвое увеличивает содержание Na+ в клетке, в 2 раза уменьшает концентрацию К+ в ней и на 38% уменьшает величину мембранного потенциала клетки. Считается возможным участие Са2+ в регуляции распределе­ния анионных метаболитов между митохондриями и цитозольным компартментом, а также в метаболизме глюкозы. По­этому поиск возможностей для оптимизации этапа бескальциевой перфузии печени остается актуальным.

Коллагеназа является единственным в настоящее время изве­стным ферментативным препаратом, обеспечивающим при адек­ватных режимах выделения получение морфологически и метабо­лически полноценных клеток. Ранее этот фермент применялся вме­сте с гиалуронидазой, которая и сейчас еще успешно используется для выделения эпителиальных клеток и адипоцитов. Однако, по мнению ряда авторов, гиалуронидаза не ока­зывает заметного действия на процесс изоляции клеток печени и исключается поэтому из состава перфузатов. Сеглен пока­зал, что в больших концентрациях гиалуронидаза может даже за­тормозить распад соединительной ткани (судя по торможению на­бухания печени). Кроме того, она увеличивает деградацию глико­гена.

Также не было найдено заметного влияния гиалуронидазы на ка­чество диспергирования клеток печени в диапазоне концентра­ции — 10-1000мг на 100мл. При высоких концентрациях фер­мента становится выраженным его протеолитическое действие. Следует, тем не менее, отметить, что присутствие гиалуронидазы в среде выделения вместе с коллагеназой, по некоторым данным, увеличивает выход клеток на 1г ткани. Одна гиалуронидаза никогда не используется для диспергирования пе­чени.

Не принесло успеха применение и других ферментов, использу­емых в качестве разрушителей межклеточного цемента, например трипсина. Его протеолитическое действие оказалось слишком высоким, и он необратимо разрушал плазматические мембраны. По многим данным его использование даже в очень низких концентрациях (0,001%) несовместимо с получением интактных клеток. Неэффективными оказались попытки использо­вать диспазу и лизосомальные ферменты.

Успешное диспергирование печени зависит, прежде всего, от качества используемой коллагеназы. Однако на сегодняшний день нет критериев, которые бы однозначно оценивали ее диспергирую­щие свойства. Различные фирмы изготовляют фермент с неста­бильными свойствами, что требует подбора рабочих концентраций фермента для каждой партии препарата. Наибольший выход не­поврежденных клеток получают при использовании коллагеназы фирм Уортингтон и Бёрингер.

Всем ферментативным препаратам в какой-то мере присуща протеолитическая активность, повреждающая мембраны клеток. Именно она накладывает ограничения на время перфузии печени ферментсодержащим раствором. Из-за высокой протеолитической активности не рекомендуется применение высокоочищенной коллагеназы. По-видимому, существуют генетические различия в чувствительности животных к ее протеолитической активности. Поэтому предпочтительно использование линейных животных.

Специфическая активность фермента, колеблющаяся в преде­лах 100-200ед/мл, слабо связана с его диспергирующей способ­ностью и не может служить критерием при сравнении препаратов разных фирм.

Концентрация фермента в перфузате может колебаться от 0,01 до 0,25%. Ряд исследователей считает оптимальной концентрацию, равную 0,03%. Наилучшие результаты получа­ют с препаратом коллагеназы в присутствии кальция, который ее активирует, и при оптимальной для нее температуре 37°С.

Успех эксперимента по диспергированию печени не только за­висит от концентрации фермента, но и во многом определяется временем ферментативной перфузии печени, которое подбирается эмпирически. При недостаточно длительном контакте ткани с раствором коллагеназы (или в случае низкой ее концентрации) межклеточные контакты полностью не разрушаются и излишние механические усилия, прикладываемые в момент диспергирования, по­вреждают клетки. Нам приходилось сталкиваться со случаями, иногда при сохранении высокой специфической активности после длительного хранения диспергирующая способность фермента резко уменьшалась, в отличие от протеолитической (неповрежденны­ми оставалось только 20-50% гепатоцитов). Подобные факты отмечались ранее и другими исследователями.

Как уже отмечалось выше, изменение температурного режима перфузии и использование этого при диспергировании печени вместо охлажденных растворов (20-22° или даже 2-4°) при температу­ре 37°С позволили резко увеличить общий выход клеток. Это связано прежде всего с тем, что именно при физиологи­ческой температуре проявляется оптимальная активность коллагеназы. Таким образом, выбор температуры перфузии печени ре­шается в настоящее время однозначно. Следует также еще раз об­ратить внимание на то, что клетки печени сохраняют высокую ме­таболическую активность во время перфузии, которая находится в тесной и прямой зависимости от температурного режима. Ее из­менение под влиянием различных факторов, в том числе темпера­турного, может кардинальным образом повлиять на метаболиче­ский статус изолированных гепатоцитов.

Постперфузионная техника получения гепатоцитов и условия сохранения их жизнедеятельности

По завершении двух этапов перфузии печени ткань находится в таком состоянии, когда межклеточные связи максимально разру­шены. Тем не менее для окончательного ее диспергирования необ­ходимо минимальное механическое воздействие. Для этого печень переносят из перфузионной камеры в пластиковую чашку Петри диаметром 100-150мм, капсулу, покрывающую печеночные доли, разрывают и ткань механически измельчают. Практически, каж­дый экспериментатор вырабатывает свои приемы мягкого ее диспергирования: с помощью острия ножниц, пластикового или ме­таллического гребня, путем шпателирования либо, наконец, отжатием в марле. При удачно проведенной процедуре перфузии пе­чень очень быстро распадается на клетки, обнажая строму белого цвета.

В отдельных случаях интенсивное встряхивание может способ­ствовать диспергированию печени на клетки, хотя некоторые исследователи не рекомендуют этого делать, так как получение сус­пензии с интактными клетками требует очень осторожных мягких механических манипуляций. Показано, что даже небольшое сдав­ливание ткани увеличивает количество клеток с поврежденной мембраной. Именно этот этап определяет состояние мембран изолированных гепатоцитов.

Очень часто сразу же после диспергирования печени применя­ют перемешивание тканевой суспензии на шейкере. Это позволяет освободиться от крупных клеточных агрегатов, осколков, легких частиц ткани и т.п. Однако эта процедура увеличивает продолжительность периода от начала диспергирования печени до момента окончательной отмывки клеток и повышает, таким образом, веро­ятность повреждения клеток продуктами распада.

Сразу же после диспергирования или через 8-10мин инкуба­ции на шейкере полученную первичную клеточную суспензию дважды фильтруют, используя различные фильтры: диаметром 100-150мкм для первой фильтрации и 61-65мкм — для второй. Двухступенчатая фильтрация служит для постепенного и последо­вательного удаления агрегатов и тканевых фрагментов без применения давления, которое способствует механическому поврежде­нию клеток. Для этих же целей применяют плоскодонные фильтры специальной конструкции. Конечная суспензия содер­жит единичные клетки и небольшие агрегаты из 2-3 клеток.

Следующий этап очистки первичной суспензии — это отделение интактных паренхиматозных клеток от поврежденных и от клеток других типов. Непаренхиматозные клетки, так же как и гепатоциты с разрушенными плазматическими мембранами, значительно легче, чем неповрежденные гепатоциты. Поэтому они могут быть удалены центрифугированием. Клетки седиментируют при низких скоростях (50g) 3-4 раза: в первый раз — 2 минуты, в остальных случаях — по 1 минуте.

Супернатант каждый раз отсасывают пипеткой, осадок осто­рожно ресуспендируют в свежем растворе до прежнего объема и снова центрифугируют. С увеличением числа оборотов растет ко­личество осажденных клеток, но одновременно увеличивается и степень «загрязненности» суспензии. Известны примеры более мяг­кого центрифугирования (30g/40с), которое обеспечивает, тем не менее, достаточный в количественном отношении выход кле­ток, и позволяет при этом избавиться от непаренхиматозных кле­ток.

Центрифугирование можно заменить гравитационным осажде­нием в течение 3-4 мин. Не дожидаясь появления четкой границы между клетками и отмывающим раствором, надосадок осторожно удаляют, ресуспендируют и повторяют эту операцию дважды. Эта процедура минимально повреждает клетки печени, но время отмывки при этом увеличивается до 15-18мин. Применение любых способов, включающих фильтрацию под отрицатель­ным давлением, исключено, так как это ведет к резкому увеличе­нию количества разрушенных клеток. Так как плотность суспензии клеток, имеющих поврежденную мембрану, несколько меньше плотности суспензии интактных клеток, а в процессе ко­роткой преинкубации это отличие усиливается из-за выхода через разрушенную мембрану ряда цитоплазматических субстанций в среду инкубации, Сеглен предложил процедуру получения очень «чистой» фракции изолированных гепатоцитов при центрифугиро­вании в градиенте плотности с использованием метризамида.

Отмывку клеточной суспензии от метаболических загрязнений проводят не менее трех раз. При этом следует иметь в виду, что в процессе отмывки гепатоциты теряют некоторые свойства, прису­щие клеткам печени в первичной суспензии. Так, например, суще­ственно уменьшается их эндогенное дыхание. Тем не менее в некоторых специальных случаях требуется очень тщательная отмывка клеток, например для удаления жировых частиц из суспензии изолированных клеток печени крыс после искусственной гиперхолестеролемии отмывку проводят 6 раз.

Очистка и отмывка гепатоцитов производятся в солевых растворах, выбираемых по тому же принципу, что и для перфузии печени. Однако кальций обязательно входит в их состав. Так же как и на 2-м этапе перфузирования, в этот период он уже не влияет на адгезионные свойства клеток, но благотворно сказывается на состоянии плазматических мембран, уплотняя их.

В отличие от предшествующего этапа все процедуры данного периода рекомендуется проводить при низких температурах (+4°-0°). Это необходимо прежде всего для того, чтобы снизить до минимума внутриклеточные метаболические процессы и благодаря этому уменьшить чувствительность гепатоцитов к стрессовым воз­действиям, главным из которых является центрифугирование. Низкая температура снижает способность клеток к реагрегации и образованию сгустков или тяжей.

Этому же помогает добавление в отмывающие растворы бычьего альбумина (1,0%) или бычьей сыворотки. Оба эти компонента, повышая вязкость среды, защищают клетки от механических раз­рушений при центрифугировании и, видимо, существенно не влия­ют на основные метаболические свойства гепатоцитов: дыхание, глюконеогенез и синтез мочевины. При отсутствии альбумина мо­жет возникнуть быстрая, почти мгновенная агглютинация гепатоцитов при ресуспендировании.




© Авторы и рецензенты: редакционный коллектив оздоровительного портала "На здоровье!". Все права защищены.


 
Текст сообщения*
Защита от автоматических сообщений
Загрузить изображение
 

nazdor.ru
На здоровье!
Беременность | Лечение | Энциклопедия | Статьи | Врачи и клиники | Сообщество


О проектеКарта сайта β На здоровье! © 2008—2015
nazdor.ru, nazdor.com
Контакты Наш устав

Рекомендации и мнения, опубликованные на сайте, являются справочными или популярными и предоставляются широкому кругу читателей для обсуждения. Указанная информация не заменяет квалифицированную медицинскую помощь, основанную на истории болезни и результатах диагностики. Обязательно проконсультируйтесь с врачом.

Размещенные на сайте информационные материалы, включая статьи, могут содержать информацию, предназначенную для пользователей старше 18 лет согласно Федеральному закону №436-ФЗ от 29.12.2010 года "О защите детей от информации, причиняющей вред их здоровью и развитию".