Пользовательский поиск

Техника перфузии печени

Перфузия печени и все необходимые процедуры, вплоть до дис­пергирования ткани на клетки, производятся in situ на наркотизи­рованном животном. Тип наркоза (при соблюдении всех осталь­ных необходимых процедур) не влияет на количество и качество выделенных клеток. Однако следует учитывать, что слиш­ком глубокий эфирный наркоз или длительная остановка кровото­ка при канюлировании v. portae могут привести к сосудистому кол­лапсу и резкому ухудшению качества перфузии. Гепатическая вазоконстрикция может быть индуцирована катехоламинами, выбра­сываемыми в кровь животных в фазе наркотического возбуждения. Поэтому Сеглен рекомендует конструкцию камеры, обеспе­чивающей постепенное поступление летучих наркотических веществ сверху. Это смягчает фазу наркотического возбуждения у животных и положительно влияет на последующий процесс дис­пергирования ткани.

Продолжение ниже

Регуляция образования глюкозы клетками печени

... глюкозо-6-фосфатом. Последний метод , применение которого стало возможным благодаря появлению в исследовательской практике суспензии изолирован­ных гепатоцитов, позволил количественно описать аналогичные циклы между фруктозо-6-фосфатом и фруктозо-1,6-дифосфатом и фосфоенолпируватом — ...

Читать дальше...

всё на эту тему


Операционная техника. Техника перфузии, впервые предложен­ная Миллером, в настоящее время достаточно хорошо отра­ботана. Брюшную полость наркотизированного животного вскрывают, в нижнюю полую вену или брыжейку тонкого кишечника вводят гепарин (500ед/мл), подводят лигатуры под v. portae, захватывая a. hepatica propria и под v. cava inf., выше v. renalis dextra. Через 1мин после введения гепарина надсекают v. portae в мезентери­альной части и немедленно ее канюлируют. Канюлю укрепляют зажимом дистальнее 1-й бифуркации v. portae и сразу же надсе­кают v. cava inf., чтобы избежать набухания печени. Затем каню­лю фиксируют двумя лигатурами. В v. cava inf. вставляют капил­ляр диаметром 1,7мм. После этого вскрывают диафрагму, под V. cava sup. подводят лигатуру, которую перевязывают или встав­ляют в нее канюлю.

Наш опыт не позволяет рекомендовать перфузию печени, по­лученной от декапитированных животных, так как в этом случае, даже если и удается получить изолированные гепатоциты с не­поврежденными мембранами, они содержат лишь следы АТФ, что говорит о выраженных катаболических процессах в них.

Естественные изменения в технике операции возникают тогда, когда имеют дело с таким объектом, как печень цыплят, у кото­рых нет диафрагмы, рыб или при получении клеток печени очень молодых животных. В последнем случае обычная процедура опе­рирования затруднена из-за мелких размеров сосудов. Поэтому ввод перфузата осуществляют через предсердие, отток — через v. portae (v. cava inf. перевязывают проксимальнее сосудистой ножки правой почки).

Для канюлирования сосудов при перфузии можно использовать как стандартные стальные иглы, на которых удобно сделать насечки для крепления лигатуры, так и пластиковые катетеры диа­метром около 2мм. Чтобы исключить попадание пузырей в сосу­дистую систему печени, сток перфузата через канюлю начинается за 20-30с до канюлирования. В литературе описаны разнообраз­ные конструкции и устройства для проведения перфузии.

Перфузия печени. Выбор адекватных режимов и продолжитель­ности перфузии являются одним из определяющих факторов полу­чения качественных гепатоцитов. Целью 1-го этапа являются отмывка печени от крови и частич­ное ослабление межклеточных контактов путем удаления кальция. Для этой цели применяется нерециркуляторная перфузия.

Бескальциевый и/или ЭГТА-содержащий раствор пропускается скоростью 15-20мл/мин. Скорость потока не может быть слишком высокой, так как последнее способствует патологическо­му набуханию печени и разрушению клеток, особенно в бескальциевой среде. Стабильность скорости потока перфузата име­ет очень большое значение для обеспечения равномерного снабжения всех участков печени коллагеназой. Поэтому факторы, нарушающие его, должны быть устранены (закупорка печеночных венул твердыми частицами, либо микроскопическими пузырьками, выделяющимися при пробулькивании 5%-ного СО2, либо за счет нерегулярного потока в перфузионной цепи). Целесообразно вво­дить в систему фильтр — газоуловитель. Свидетельством правильного хода отмывки служат очень быстрое, равномерное по всей поверхности осветление печени и отсутствие мозаичных пятен бурокоричневого цвета, из которых не была удалена кровь при не­равномерном потоке перфузата. Следовательно, в этом случае име­ются предпосылки для неадекватного их снабжения энзимом. Та­кие участки являются источником клеток с поврежденными плаз­матическими мембранами и повышенной способностью к слипанию. Эти включения должны быть устранены очень мягким масса­жем.

В ранних работах время перфузии бескальциевой средой со­ставляло 15-20мин. Эмпирически накопленный опыт пока­зал, что оно может быть уменьшено до 7-8мин без отрицательно­го влияния на качество получаемых клеток. Объем перфузата, ис­пользуемый на этапе нерециркуляторного режима, составляет 200-300мл.

На 2-м этапе перфузию печени проводят фермент- и Са-содержащим раствором с целью окончательного разрушения межкле­точного цемента. Ради экономии фермента цепь перфузии замыка­ют (рециркуляторная перфузия). Незамкнутая система перфузии может быть сохранена при работе с мелкими животными, когда для диспергирования печени даже в таких условиях достаточно небольших (200мл) количеств перфузата, протекающего со скоростью 10мл/мин.

Замкнутую перфузию 2-го этапа можно проводить in situ. Од­нако, как правило, перфузируемую печень экстирпируют и всю по­следующую процедуру осуществляют в перфузионной камере, т.е. в условиях in vitro. Оптимальный режим подачи перфузата обес­печивается при скорости 25-35мл/мин и давлении 10-20мм во­дяного столба. При этом для создания нужного давления в сосу­дистом русле обязательно должно иметь место небольшое набуха­ние печени. Время, в течение которого печень омывается содержа­щим фермент перфузатом, определяется активностью последнего.

Через 3-5мин после перфузии печени раствором коллагеназы поверхность печени приобретает специфический вид: становится заметна сетчатая микроструктура ткани. При мягком надавлива­нии кончиком пластиковой трубки на поверхность печени можно увидеть медленно исчезающий след. Еще через 4-7мин подоб­ная манипуляция приводит к появлению рваного отверстия, из которого, как это легко заметить, происходит вытекание перфузата. Это — признак завершения диспергирования ткани. Другим эмпи­рическим признаком являются истончение острых краев отдель­ных долек, появление некоторой их прозрачности и заметное уве­личение количества перфузата, выступающего на поверхности пе­чени.

Момент полного разрушения межклеточных контактов сопро­вождается заметным уменьшением объемной скорости перфузата из канюли, введенной в v. cava inf. Это обстоятельство может быть использовано для объективной оценки диспергирования тка­ни и ее готовности к механическому разделению клеток, так как с уменьшением количества жидкости, прошедшей через сосуды пе­чени, уменьшается и количество кислорода, потребляемого орга­ном за единицу времени. Увеличение стационарной концентрации О2 или уменьшение разницы по О2 между притекающим и оттека­ющим перфузатом указывают на завершение процесса фермента­тивного разрушения соединительной ткани. В этот момент часто наблюдается сплющивание печени.

Сеглен отмечает, что при правильно проведен­ной перфузии к моменту ее завершения объем печени увеличивает­ся примерно вдвое из-за набухания. Показателем завершения дис­пергирования ткани могут быть также изменения температуры по­верхности перфузируемой печени. Однако опыт показывает, что совокупность внешних признаков не может в настоящее время быть стандартизована для оценки степени разрушения межкле­точных контактов и определяется самим экспериментатором.

Общее время реперфузии с ферментсодержащим раствором, указываемое в последних работах, не превышает 15-20мин. В некоторых экспериментах при использовании свежей коллагеназы фир­мы Уортингтон оно составляло 6-7мин.

Имеются модификации перфузии печени, основанные на изме­нении направления потока перфузата спустя некоторое время (10-15мин) после начала 2-го этапа. Целью этого приема явля­ется уменьшение изменений, вызванных частичным разрушением сосудистой стенки в районе входа перфузионного потока через v. portae. При этом он направляется через v. cava sup. и выходит через v. portae. Нижнюю полую вену перевязывают. Однако практика работы показала, что такая про­цедура может быть опущена без ущерба для качества полученных клеток.

Следует, однако, отметить, что можно проводить диспергирова­ние ткани неперфузионным методом. При этом сохраняется обяза­тельная преперфузия печени бескальциевым раствором. Затем из печени приготовляют срезы толщиной не более 0,7мм, которые инкубируют в ферментсодержащих растворах. Такой способ дает меньший выход клеток, чем перфузионный (в 2-10 раз), но обеспечивает интактность их плазматических мембран.

Метаболические свойства гепатоцитов, выделенных энзиматическим способом из срезов, по данным одних авторов, слегка ухуд­шены по сравнению с клетками, полученными перфузионным спо­нсором, по другим данным — такие же. Благодаря нали­чию в суспензии таких клеток мембранных фрагментов, способст­вующих увеличению адгезии, гепатоциты, как правило, агрегиро­ваны и одиночные клетки единичны.

Тем не менее использование этого способа может иметь преи­мущества в определенных ситуациях, например при работе с биоп­сийным материалом или на мелких животных, когда невозможна перфузия печени.

Составы сред на этапе перфузии по своим свойствам должны приближаться к межклеточной жидкости, чтобы обеспечить мак­симальное сохранение метаболических свойств органа, присущих ему in vivo. Они должны обладать достаточным онкотическим давлением, необходимым ионным составом, обеспечивать поддер­жание физиологических значений pH, температуры, оксигенации и пр. При этом должны сохраняться условия для эффективного действия диспергирующих агентов.

Многочисленные работы подтверждают, что такие среды, как раствор Хенкса, Рингера, Кребс-Хенселейта, Тироде и другие, могут быть взя­ты за основу при выборе состава перфузата.

Наиболее адекватными являются бикарбонатные буферы, кото­рые, однако, эффективны лишь при насыщении 5% СО2. Постоян­ство рСО2 среды выделения (или инкубации) существенно для глюконеогенеза из лактата, синтеза мочевины и для некоторых других функций гепатоцита. Смеси NaHCО3 и Na23 облада­ют способностью поддерживать стационарный уровень рСО2 рас­творов и поэтому входят в состав многих буферов.

При подборе сред выделения следует учитывать, что, если плазматические мембраны гепатоцитов повреждены, как это име­ет место при механическом или химическом способах выделения, некоторые их компоненты могут отрицательно сказаться на со­стоянии клеток. Показано, например, что высокие концентрации, сахарозы (более 0,25М) вызывают патологическое набухание внешней мембраны митохондрий аналогично тому, как это имеет место в изолированных митохондриях. Так же как и в митохондриях, кальций и ортофосфат ингибируют дыхание гепа­тоцитов с поврежденными мембранами.

Так как этап перфузии занимает около 60мин, в перфузирующие среды, как правило, не добавляют субстраты окисления. От­сутствие экзогенных субстратов в течение сравнительно короткого времени существенно не влияет на метаболические свойства ткани и гепатоцитов в последующем.

Исключением являются случаи, когда возникает необходимость предотвратить гликогенолиз в печени сытых животных, что дости­гается введением высоких концентраций глюкозы (20мМ) либо уменьшить потери глутатиоиа за счет добавления в среду ме­тионина.

Буферная емкость среды имеет очень большое значение. Она должна быть очень высокой, так как метаболиты печени во время перфузии и инкубации срезов и изолированных клеток сильно сдвигают pH среды в кислую сторону, особенно в первые 10-15мин. Перечисленные выше среды и по составу и по соотношению ионов соответствуют межклеточной жидкости или плазме крови. При осмомолярности около 300мосМ они обес­печивают осмотическое давление порядка 7,7атм при 37°С.

Очень высокой буферной емкостью обладает бикарбонатный буфер в присутствии 5% СО2. Он позволяет надежно поддерживать pH среды в пределах 7,3-7,5. Поэтому в процессе выделения ге­патоцитов перфузат обычно насыщают карбогеном. При перфузии печени взрослой крысы объем перфузата в замкнутой системе ра­вен 100-200мл. Буферной емкости такой среды при использова­нии бикарбонатного буфера достаточно для поддержания pH в указанных пределах. Наш опыт показывает, однако, что при умень­шении объема перфузата до 50мл и ниже, когда из-за метаболи­тов печени возможность закисления среды резко увеличивается, целесообразно добавлять 10-20мМ органического буфера, с вы­сокой буферной емкостью (HEPES, TES, Tricine).

Фосфатные буферы имеют низкую буферную емкость и к тому же подавляют реакции с участием бикарбоната (например, синтез мочевины и жирных кислот), поэтому они не использу­ются при приготовлении сред выделения и инкубации.

Среды, содержащие растворимые белки плазмы, обладают очень высокой буферной емкостью, поэтому в состав перфузионных сред часто включается альбумин. Его роль, однако, заключается не только в улучшении буферных свойств. Будучи нейтральным относительно метаболизма печени, он увеличивает осмотическое давление и вязкость растворов и соответственно дав­ление в перфузате, что в условиях субоптимальной скорости пото­ка обеспечивает более равномерное распределение кислорода в перфузируемой печени. Кроме того, он уменьшает протеолитическое воздействие коллагеназы, предохраняя мембранные белки от протеаз. Обычно используемый 2%-ный раствор бычьего сыворо­точного альбумина создает осмотическое давление около 0,1атм, что составляет менее 0,2% давления неорганической компоненты перфузата.

В этой связи следует напомнить, что альбумин широко приме­няется при перфузии органов не только для создания достаточного онкотического давления, но и главным образом для предупрежде­ния чрезмерного набухания ткани при осмотической трансфузии воды из русла сосудов в межклеточное пространство. Последнее может происходить потому, что стенки сосудов легко проницаемы для воды и солей, но не пропускают белковые молекулы. Ничего подобного не наблюдается при перфузии печени с целью дисперования гепатоцитов; под действием коллагеназы разрушается стенка сосудов, и перфузат непосредственно омывает мембраны клеток печени. Создание дополнительного онкотического давления в среде теряет свою актуальность.

Необходимо учитывать, что присутствие альбумина в среде выделения клеток вносит ряд отрицательных моментов. Из-за частичного связывания диспергирующего фермента с альбумином по­здний снижает выход клеток и увеличивает их способность к агглютинации. Кроме того, из-за возросшей вязкости раствора в его присутствии возрастает опасность закупорки сосудов, и благодаря этому – ухудшения качества перфузии через мелкие капилляры.

Применение белкового раствора в качестве среды перфузии создает также дополнительные трудности при пропускании газовых смесей через раствор для создания достаточных рСО2 и рО2. Поэтому мы разделяем точку зрения большинства эксперимента­торов, считающих нерациональным включение бычьего сывороточного альбумина в состав среды выделения при перфузии печени.

Закисление среды отрицательно сказывается на жизнедеятельности клеток печени, и pH не должен уменьшаться ниже 7,3, а начальные его значения с учетом последующего сдвига могут быть равны 7,6. В этом же диапазоне (рН=7,5) нахо­дится и оптимум активности коллагеназы, т.е. создаются условия для максимального набухания печени на этапе ферментативной перфузии. При pH среды выше 8,4 гепатоциты погибают.

Поддержание стационарного pH в перфузате может осуществляться автоматически непрерывным добавлением NaOH либо путем непрерывного газирования бикарбонатного буфера 5% СО2. Однако этот процесс может сопровождаться образованием и выпадением в осадок нерастворимых частиц, которые способны закупоривать венулы. Поэтому органические буферы с высокой буферной емкостью имеют серьезные преимущества для фактического использования (HEPES, TES, Tricine).

Замена одной буферной среды на другую производится, как правило, переключением перфузионных резервуаров в цепи рецир­куляции. Некоторые авторы предпочитают перемещение препарата изолированной печени целиком в другую перфузионную камеру. Это технически несколько сложнее, но зато позволяет избежать перепадов при смене трубок и появления пузырей в соединитель­ных шлангах.

Оксигенация сред выделения при перфузии печени является обязательным условием получения жизнеспособных и метаболиче­ски полноценных гепатоцитов. Так как рО2 в физиологических рас­творах при 37°С составляет примерно 200мкМ, полное его исчер­пание произойдет примерно за 20мин, если не производить допол­нительного насыщения кислородом перфузионных сред, а уже че­рез 10мин клетки органа окажутся в гипоксических условиях. Эта ситуация была экспериментально продемонстрирована Берри и Френдом, которые показали, что если в условиях перфузионной системы концентрация кислорода в притекающем перфузате была равна 315мкМ, то на выходе она составляла не более 125мкМ. При насыщении исходного раствора кислородом до 600мкМ его концентрация в оттекающем перфузате падала менее чем за 30 минут до 300мкМ.

Высокая скорость дыхания перфузируемой печени требует поддержания соответственно высокой концентрации кислорода в перфузате. Как правило, для его насыщения до 500-700мкМ используют карбоген (95% О2 + 5% СО2), который пропускают через раствор в течение 10-15мин. Тем не менее Сеглен считает, что короткий период гипоксии (до 30мин) не вносит необратимых нарушений в метаболизм печени: дыхание печени полностью восстанавливается в период реоксигенации и клеточные препараты сохраняют свою жизнеспособность. Поэтому перфузионная оксигенация карбогеном заменяется иногда обработкой газовой смесью (воздух + 5% СО2) в присутствии органических буферов.

Однако постепенно накапливаются данные о том, что если барботирование такой газовой смесью и не приводит к увеличению количества поврежденных клеток, оно сказывается на метаболической активности гепатоцитов, в частности – на скорости синтеза в них альбумина и на скорости образования глюкозы из лактата, что связано с гипоксией, развивающейся в этих условиях. Клетки, полученные при такой перфузии, имеют некоторые морфологические аномальности, обнаруживаемые с помощью электронной микроскопии (вакуоляризация цитозоля и эндоплазматического ретикулума, сокращение митохондриального матрик­са). Хотя эти изменения обратимы, оксигенация перфузата воздухом, видимо, недостаточна для создания оптимальных условий переживания клеток.

Высокие требования к оксигенации предъявляются и при выде­лении гепатоцитов из срезов. Среды, используемые при этом, дол­жны быть насыщены кислородом, иначе наблюдаются потери гли­когена клетками и их дегенерация.




© Авторы и рецензенты: редакционный коллектив оздоровительного портала "На здоровье!". Все права защищены.


 
Текст сообщения*
Защита от автоматических сообщений
Загрузить изображение
 

nazdor.ru
На здоровье!

Пользовательский поиск

Узнайте больше:

Регуляция образования глюкозы клетками печени


А.Г. Маленков о монографии Л.Д. Лукьяновой «Гепатоцит»


Роль восстановленного глутатиона при индукции ПОЛ в гепатоцитах


Дыхание как показатель функционального состояния изолированных гепатоцитов


Роль гепатоцита в исследованиях печени


Эндоцитоз гликопротеидов в гепатоцитах


Перекисное окисление липидов в гепатоцитах


Функция плазматической мембраны гепатоцитов


Дыхание изолированных гепатоцитов, сопряженное с активностью митохондриальной дыхательной цепи


Количественные характеристики гепатоцитов


Всё на тему гепатоцит, исследования



Большинство диет для похудения просто крадут ваши деньги

Логин:

Пароль:



Забыли свой пароль?
Регистрация
войти / регистрация

Беременность | Лечение | Энциклопедия | Статьи | Врачи и клиники | Сообщество


О проектеКарта сайта β На здоровье! © 2008—2015
nazdor.ru, nazdor.com
Контакты Наш устав

Рекомендации и мнения, опубликованные на сайте, являются справочными или популярными и предоставляются широкому кругу читателей для обсуждения. Указанная информация не заменяет квалифицированную медицинскую помощь, основанную на истории болезни и результатах диагностики. Обязательно проконсультируйтесь с врачом.

Размещенные на сайте информационные материалы, включая статьи, могут содержать информацию, предназначенную для пользователей старше 18 лет согласно Федеральному закону №436-ФЗ от 29.12.2010 года "О защите детей от информации, причиняющей вред их здоровью и развитию".