Впервые гепатоциты были выделены около 40 лет назад Эллиотом и Либером, которые обнаружили, что изотонические среды в отличие от гипотонических, а также раствор сахарозы, предотвращают цитолиз клеток. Ими же было показано, что в гомогенатах печени, инкубируемых в таких средах, содержится много хорошо сохранившихся изолированных клеток, собранных иногда в группы. Вскоре после этого была установлена зависимость выхода целых клеток от качества гомогенизации.
В первых работах по получению изолированных гепатоцитов применялся в основном механический способ диспергирования печени. Разнообразные приемы, используемые при этом, сводились к механическому измельчению ткани с последующими инкубацией кусочков в буферной среде, фильтрацией тканевой суспензии и осаждением клеток. Несовершенство этого способа в целом обнаруживалось уже при простой микроскопии: клетки были неправильной формы, имели частично разрушенную плазматическую мембрану и сильно поврежденные микроворсинки. Выход клеток, как правило, был небольшим (5-10% от исходного веса печени), но даже в случае более удачных выделений в полученной суспензии имелось много разрушенных клеток, осколков, цитоплазматических частиц.
Метаболическая реактивность таких клеток резко отличалась от срезов и интактной печени. Они были неспособны окислять углеводы, что могло быть связано с потерей отмытыми клетками ряда цитоплазматических ферментов, в том числе гликолитических. Главной же их особенностью было чрезвычайно низкое эндогенное дыхание, которое не восстанавливалось глюкозой и другими субстратами. Стимуляция дыхания наблюдалась только в присутствии сукцината.
Резкие различия метаболических свойств этих первых гепатоцитов сравнительно со срезами и печенью in situ ограничивали их практическое использование и толкали на поиски качественно новых подходов и приемов выделения, которые стимулировались запросами преимущественно биохимических и морфологических исследований.
Второй этап в истории получения изолированных гепатоцитов (химическое диспергирование печени) связан с установлением роли ионов кальция в формировании и функционировании межклеточных контактов. Естественно, что в связи с этим появились попытки удалить легко растворимые соли кальция из межклеточного цемента различными хелаторами (ЭДТА, цитрат, оксалат). Андерсон первый применил их при перфузии печени для связывания кальция, благодаря чему выход клеток удалось существенно увеличить. Начиная с этой работы перфузия печени бескальциевыми и хелатсодержащими растворами или инкубация срезов в них становятся обязательным этапом выделения клеток.
Попытки использовать для выделения изолированных клеток печени хелаторы других ионов, например тетрафенилборон (хелатор калия) и ЭГТА (хелатор кальция), не принесли успеха.
Однако, несмотря на примененные нововведения, за счет которых удалось увеличить выход клеток, их качество существенным образом не улучшилось. К механическим повреждениям добавились декальцинация и химическое воздействие хелаторов, которые, по мнению ряда исследователей, были даже еще более травмирующими, так как приводили к качественным изменениям свойств плазматической мембраны.
Клетки, получаемые с помощью химико-механических способов, по-прежнему имели серьезные морфологические нарушения практически всех субклеточных структур, что не позволяло рассматривать их как интактный объект. Их мембрана была истончена и имела иррегулярную толщину и разрывы. Клетки в цитоплазме содержали большое количество мелких вакуолей. Отмечались повышенная везикуляризация эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи, а также асимметричное набухание внешней мембраны митохондрий. Ядро часто имело неправильную форму и низкую электронную плотность; наблюдался лизис ядерного хроматина. Клетки интенсивно прокрашивались трипановым синим, что свидетельствовало о нарушении интактности их плазматической мембраны.
Наличие поврежденной мембраны способствовало полной потере растворимых энзимов цитоплазмы (лактатдегидрогеназы, изоцитратдегидрогеназы, альдолазы, треониндегидрогеназы, сериндегидрогеназы, триптофанпирролазы, фосфорилазы) и частичной потере таких ферментов, как малатдегидрогеназа, глутаматдегидрогеназа, глутаматоксалоацетаттрансаминаза, глутаминпируваттрансаминаза, глицерофосфатдегидрогеназа, глюкозо-6-фосфатаза и др.
Наряду с потерей ферментов гликолиза имело место снижение содержания гликогена: по ходу препаровки клетка теряла за 30мин до 60% гликогена. В отличие от этого в срезах печени потери гликогена были минимальны. Образование глюкозы и включение аминокислот в белки также были снижены, а свободные жирные кислоты не аккумулировались в клетках при инкубации. Гепатоциты теряли способность сравнительно со срезами синтезировать холестерол. Они по-прежнему обладали чрезвычайно низким эндогенным дыханием, которое не восстанавливалось глюкозой, белковыми и небелковыми факторами, а также высокой скоростью окисления сукцината. Последнее свидетельствует о нарушении проницаемости клеточной мембраны для субстратов. Клетки были неспособны превращать углеводы в молочную кислоту. Все эти изменения сопровождались потерей селективной проницаемости клеточной мембраны, выражающейся в ее неспособности поддерживать концентрационный градиент ионов, и в связи с этим протекали на фоне резкого снижения содержания внутриклеточного калия.
Существенное улучшение структуры и метаболических свойств гепатоцитов было получено лишь тогда, когда была сделана попытка совместить механический, химический и энзиматический способы обработки перфузируемой печени. Поворотным моментом в истории выделения гепатоцитов являются работы Говарда и соавторов. Эти исследователи применили для облегчения процесса диспергирования печени коллагеназу и гиалуронидазу, уже использовавшиеся ранее при выделении адипоцитов и эпителиальных клеток молочной железы у мышей. После предварительной отмывки печени от крови бескальциевым раствором ее механически измельчали на сравнительно небольшие (0,7мм толщины) кусочки, которые длительно (40мин) инкубировали в растворе, содержащем 0,005% коллагеназы и 0,1% гиалуронидазы. Затем их измельчали шпателем в холодном буферном растворе. Полученные таким образом клетки обладали сравнительно высоким исходным эндогенным дыханием. До 75% клеток были непроницаемы для красителя трипанового синего.
В более поздней модификации этого способа была введена перфузия печени in situ холодным раствором, содержащим ферменты, разрушающие межклеточный цемент. Однако общее количество клеток в суспензии продолжало оставаться небольшим и составляло немногим больше 10% от всей популяции клеток печени, что было, видимо, связано с неадекватным температурным режимом. Оптимизация последнего (применение после отмывки печени от крови рециркуляторной перфузии теплым — 37–38°С — ферментосодержащим буферным раствором) способствовала максимальному ослаблению межклеточных контактов. Оно становилось настолько ощутимым, что достаточно было незначительных усилий, чтобы завершить процесс диспергирования ткани.
Завершающим моментом в истории развития выделения гепатоцитов явились работы Сеглена, которому удалось свести до минимума механическое воздействие на ткань. В первом варианте способ Сеглена состоял из трех этапов:
1) нерециркуляторной перфузии печени, целью которой является удаление Са2+-зависимого фактора, влияющего на адгезионные свойства клеток печени (оно достигается использованием бескальциевой сбалансированной среды или среды, содержащей хелатор кальция — ЭГТА);
2) рециркуляторной перфузии печени с целью ферментативного разрушения межклеточных контактов бескальциевым раствором, содержащим коллагеназу (и гиалуронидазу);
3) введения кальция в ферментсодержащий перфузионный раствор с целью активации коллагеназы.
Однако, как только стало ясно, что кальций, введенный после первичной декальцинации, не восстанавливает межклеточные контакты, необходимость разделения на 2-й и 3-й этапы отпала. В своих последних работах Сеглен применял уже только два этапа— 1-й и 3-й, Он же провел систематическое изучение факторов, влияющих на количественные и качественные характеристики получаемой суспензии клеток, превратив тем самым набор способов в определенную методологию.
Гепатоциты, получаемые энзиматическим способом, как правило, сохраняют интактность плазматической мембраны: количество прокрашенных трипановым синим клеток составляет по данным разных авторов всего 5-20%.
Отсутствие повреждений поверхности плазматических мембран обеспечивает высокий мембранный потенциал и сводит к минимуму потери цитоплазматических энзимов, и прежде всего лактатдегидрогеназы, а также выход К+ из клетки в экстрацеллюлярное пространство. Ультратонкая структура клеток не нарушается, эндоплазматический ретикулум и митохондрии сохраняют интактность.
Метаболические свойства таких клеток мало отличаются от срезов и целой печени. В них сохранены синтез альбумина, фибриногена и трансферина. Они способны к гликолизу и глюконеогенезу. В них сохраняется способность к включению аминокислот в белки и к синтезу жирных кислот. Характерным является высокое эндогенное дыхание таких клеток. Сукцинат слабо, либо вообще не стимулирует их дыхание. Таким образом, была завершена длительная методическая работа, позволившая экспериментаторам получить великолепную модель для изучения самых различных метаболических процессов в условиях in vitro. Многочисленные более поздние модификации основополагающих работ Говарда, Берри и Френда и Сеглена не представляют собой уже ничего принципиально нового и отражают опыт какой-либо конкретной лаборатории применительно к выбранной технике и имеющейся аппаратуре, а также к усовершенствованию сред и сопутствующих условий выделения (оксигенации, температурного режима, pH и пр.). Все они обеспечивают, как правило, близкие результаты.
