Пользовательский поиск

История и способы получения изолированных гепатоцитов

Впервые гепатоциты были выделены около 40 лет назад Эл­лиотом и Либером, которые обнаружили, что изотонические среды в отличие от гипотонических, а также раствор сахарозы, предотвращают цитолиз клеток. Ими же было показано, что в гомогенатах печени, инкубируемых в таких средах, содержится мно­го хорошо сохранившихся изолированных клеток, собранных иног­да в группы. Вскоре после этого была установлена зависимость выхода целых клеток от качества гомогенизации.

Продолжение ниже

Значение изменения внутренних органов при алкоголизме

... который, как выяснилось при изучении нервной системы кроликов I серии эксперимента, возникает лишь в III периоде и является наиболее характерным ... ... ограничивалось очаговыми лимфоидными инфильтратами в различных органах - печени почках и миокарде. Иногда в почке эти лимфоидные инфильтраты сопровождались ...

Читать дальше...

всё на эту тему


В первых работах по получению изолированных гепатоцитов применялся в основном механический способ диспергирования пе­чени. Разнообразные приемы, используемые при этом, сводились к механическому измель­чению ткани с последующими инкубацией кусочков в буферной среде, фильтрацией тканевой суспензии и осаждением клеток. Не­совершенство этого способа в целом обнаруживалось уже при про­стой микроскопии: клетки были неправильной формы, имели час­тично разрушенную плазматическую мембрану и сильно поврежденные микроворсинки. Выход клеток, как пра­вило, был небольшим (5-10% от исходного веса печени), но да­же в случае более удачных выделений в полученной суспензии имелось много разрушенных клеток, осколков, цитоплазматиче­ских частиц.

Метаболическая реактивность таких клеток резко отличалась от срезов и интактной печени. Они были неспособны окислять уг­леводы, что могло быть связано с потерей отмытыми клет­ками ряда цитоплазматических ферментов, в том числе гликолитических. Главной же их особенностью было чрезвычай­но низкое эндогенное дыхание, которое не восстанавли­валось глюкозой и другими субстратами. Стимуляция дыхания на­блюдалась только в присутствии сукцината.

Резкие различия метаболических свойств этих первых гепато­цитов сравнительно со срезами и печенью in situ ограничивали их практическое использование и толкали на поиски качественно но­вых подходов и приемов выделения, которые стимулировались запросами преимущественно биохимических и морфологических ис­следований.

Второй этап в истории получения изолированных гепатоцитов (химическое диспергирование печени) связан с установлением ро­ли ионов кальция в формировании и функционировании межкле­точных контактов. Естественно, что в связи с этим появились по­пытки удалить легко растворимые соли кальция из межклеточно­го цемента различными хелаторами (ЭДТА, цитрат, оксалат). Андерсон первый применил их при перфузии печени для связы­вания кальция, благодаря чему выход клеток удалось существен­но увеличить. Начиная с этой работы перфузия печени бескальциевыми и хелатсодержащими  растворами или инкубация срезов в них становятся обязательным этапом выделения клеток.

Попытки использовать для выделения изолированных клеток печени хелаторы других ионов, например тетрафенилборон (хелатор калия) и ЭГТА (хелатор кальция), не принесли успеха.

Однако, несмотря на примененные нововведения, за счет кото­рых удалось увеличить выход клеток, их качество существенным образом не улучшилось. К механическим повреждениям добави­лись декальцинация и химическое воздействие хелаторов, которые, по мнению ряда исследователей, были даже еще более травмиру­ющими, так как приводили к качественным изменениям свойств плазматической мембраны.

Клетки, получаемые с помощью химико-механических спосо­бов, по-прежнему имели серьезные морфологические нарушения практически всех субклеточных структур, что не позволяло рас­сматривать их как интактный объект. Их мембрана была истонче­на и имела иррегулярную толщину и разрывы. Клетки в цитоплаз­ме содержали большое количество мелких вакуолей. Отмечались повышенная везикуляризация эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи, а также асимметричное набухание внешней мембраны митохондрий. Ядро часто имело неправильную форму и низкую электронную плотность; наблюдался лизис ядерного хро­матина. Клетки интенсивно прокрашива­лись трипановым синим, что свидетельствовало о нарушении интактности их плазматической мембраны.

Наличие поврежденной мембраны способствовало полной поте­ре растворимых энзимов цитоплазмы (лактатдегидрогеназы, изоцитратдегидрогеназы, альдолазы, треониндегидрогеназы, сериндегидрогеназы, триптофанпирролазы, фосфорилазы) и частичной потере таких ферментов, как малатдегидрогеназа, глутаматдегидрогеназа, глутаматоксалоацетаттрансаминаза, глутаминпируваттрансаминаза, глицерофосфатдегидрогеназа, глюкозо-6-фосфатаза и др.

Наряду с потерей ферментов гликолиза имело место снижение содержания гликогена: по ходу препаровки клетка теряла за 30мин до 60% гликогена. В отличие от этого в срезах печени по­тери гликогена были минимальны. Образование глюко­зы и включение аминокислот в белки также были снижены, а свободные жирные кислоты не аккумулировались в клетках при инкубации. Гепатоциты теряли способность сравнительно со срезами синтезировать холестерол. Они по-прежнему обладали чрезвычайно низким эндогенным дыханием, которое не восстанавливалось глюкозой, белковыми и небелковыми факторами, а также высокой скоростью окисления сукцината. Последнее свидетельствует о нарушении прони­цаемости клеточной мембраны для субстратов. Клетки были неспособны превращать углеводы в молочную кислоту. Все эти изменения сопровождались потерей селективной проницаемости клеточной мембраны, выражающейся в ее неспособности поддер­живать концентрационный градиент ионов, и в связи с этим протекали на фоне резкого снижения содержания внутриклеточного калия.

Существенное улучшение структуры и метаболических свойств гепатоцитов было получено лишь тогда, когда была сделана по­пытка совместить механический, химический и энзиматический способы обработки перфузируемой печени. Поворотным моментом в истории выделения гепатоцитов являются работы Говарда и со­авторов. Эти исследователи применили для облегчения процесса диспергирования печени коллагеназу и гиалуронидазу, уже использовавшиеся ранее при выделении адипоцитов и эпителиальных клеток молочной железы у мышей. После предварительной отмывки печени от крови бескальциевым раствором ее механически измельчали на сравнительно небольшие (0,7мм толщины) кусочки, которые длительно (40мин) инкубировали в растворе, содер­жащем 0,005% коллагеназы и 0,1% гиалуронидазы. Затем их из­мельчали шпателем в холодном буферном растворе. Полученные таким образом клетки обладали сравнительно высоким исходным эндогенным дыханием. До 75% клеток были непроницаемы для красителя трипанового синего.

В более поздней модификации этого способа была введена перфузия печени in situ холодным раствором, содержащим ферменты, разрушающие межклеточный цемент. Однако общее количество клеток в суспензии продолжало оставаться небольшим и составляло немногим больше 10% от всей популяции клеток пе­чени, что было, видимо, связано с неадекватным температурным режимом. Оптимизация последнего (применение после отмывки печени от крови рециркуляторной перфузии теплым — 37–38°С — ферментосодержащим буферным раствором) способствовала мак­симальному ослаблению межклеточных контактов. Оно ста­новилось настолько ощутимым, что достаточно было незначитель­ных усилий, чтобы завершить процесс диспергирования ткани.

Завершающим моментом в истории развития выделения гепа­тоцитов явились работы Сеглена, которому удалось свести до минимума механическое воздействие на ткань. В первом варианте способ Сеглена состоял из трех этапов:

1) нерециркуляторной перфузии печени, целью которой является удаление Са2+-зависимого фактора, влияющего на адгезионные свойства клеток пе­чени (оно достигается использованием бескальциевой сбалансиро­ванной среды или среды, содержащей хелатор кальция — ЭГТА);

2) рециркуляторной перфузии печени с целью ферментативного разрушения межклеточных контактов бескальциевым раствором, содержащим коллагеназу (и гиалуронидазу);

3) введения кальция в ферментсодержащий перфузионный раствор с целью активации коллагеназы.

Однако, как только стало ясно, что кальций, введенный после первичной декальцинации, не восстанавливает межклеточные кон­такты, необходимость разделения на 2-й и 3-й этапы отпала. В своих последних работах Сеглен применял уже только два эта­па— 1-й и 3-й, Он же провел систематическое изучение фак­торов, влияющих на количественные и качественные характеристи­ки получаемой суспензии клеток, превратив тем самым набор способов в определенную методологию.

Гепатоциты, получаемые энзиматическим способом, как пра­вило, сохраняют интактность плазматической мембраны: количест­во прокрашенных трипановым синим клеток составляет по данным разных авторов всего 5-20%.

Отсутствие повреждений поверхности плазматических мембран обеспечивает высокий мембранный потенциал и сводит к минимуму потери цитоплазматических энзимов, и прежде всего лактатдегидрогеназы, а также выход К+ из клетки в экстрацеллюлярное пространство. Ультратонкая струк­тура клеток не нарушается, эндоплазматический ретикулум и ми­тохондрии сохраняют интактность.

Метаболические свойства таких клеток мало отличаются от срезов и целой печени. В них сохранены синтез альбумина, фибриногена и трансферина. Они способны к гликолизу и глюконеогенезу. В них сохраняется способность к включению аминокислот в белки и к синтезу жирных кислот. Характерным является высокое эндогенное дыхание таких клеток. Сукцинат слабо, либо вообще не стимулирует их дыхание. Таким образом, была завершена длительная методическая ра­бота, позволившая экспериментаторам получить великолепную модель для изучения самых различных метаболических процессов в условиях in vitro. Многочисленные более поздние модификации основополагающих работ Говарда, Берри и Френда и Сеглена не представляют собой уже ничего принципиально нового и отража­ют опыт какой-либо конкретной лаборатории применительно к вы­бранной технике и имеющейся аппаратуре, а также к усовершен­ствованию сред и сопутствующих условий выделения (оксигенации, температурного режима, pH и пр.). Все они обеспечивают, как правило, близкие результаты.




© Авторы и рецензенты: редакционный коллектив оздоровительного портала "На здоровье!". Все права защищены.


 
Текст сообщения*
Защита от автоматических сообщений
Загрузить изображение
 

nazdor.ru
На здоровье!
Беременность | Лечение | Энциклопедия | Статьи | Врачи и клиники | Сообщество


О проектеКарта сайта β На здоровье! © 2008—2015
nazdor.ru, nazdor.com
Контакты Наш устав

Рекомендации и мнения, опубликованные на сайте, являются справочными или популярными и предоставляются широкому кругу читателей для обсуждения. Указанная информация не заменяет квалифицированную медицинскую помощь, основанную на истории болезни и результатах диагностики. Обязательно проконсультируйтесь с врачом.

Размещенные на сайте информационные материалы, включая статьи, могут содержать информацию, предназначенную для пользователей старше 18 лет согласно Федеральному закону №436-ФЗ от 29.12.2010 года "О защите детей от информации, причиняющей вред их здоровью и развитию".