Пользовательский поиск

Гистология - образцы, красители и артефакты

гистологияГистология (термин образован соединением греческих слов «histos»-«ткань» и «-logia»-«наука») – это исследование анатомии клеток и тканей представителей растительного и животного мира в микроскопическом масштабе. Как правило, оно проводится посредством анализа тканей и клеток при помощи среза и окрашивания с последующим изучением под световым или электронным микроскопом. Можно проводить гистологические исследования с помощью тканевой культуры, где можно выделить живые клетки и поддерживать их в надлежащей среде за пределами организма в различных научно-исследовательских работах. Способность визуализировать или дифференциально определять микроскопические структуры часто повышается за счет использования гистологических красителей. Наука гистологии служит важным инструментом для биологии и медицины.

Продолжение ниже

Медицинская морфометрия

... уровнях его структур­ной организации при различных нарушениях функций, патоло­гических процессах и болезнях. История развития анатомии, гистологии и патологической анатомии, изучающей обобщенные морфологические стереотипы, свидетельствует о возможностях детального описания ...

Читать дальше...

всё на эту тему


Большое значение для анатомической патологии имеет гистопатология, представляющая собой изучение пораженной ткани под микроскопом. Гистопатологическая экспертиза образцов необходима для точной диагностики онкологических и других заболеваний. Гистопатологические исследования проводятся квалифицированные врачи, зачастую это сертифицированные патологоанатомы, которые занимаются подготовкой диагностической информации на основе своих наблюдений.

Подготовкой гистологических срезов занимаются квалифицированные ученые, среди которых гистотехники, ученые-медики, техники и технологи гистологии, биомедики или медицинские лаборанты. Область их исследований называется гистотехнологией.

Содержание

  1. Подготовка образца
    1. Фиксация
    2. Обработка – дегидратация, очистка и инфильтрация
    3. Заливка
    4. Срез
    5. Окрашивание
  2. Видео о гистологии
  3. Распространенные лабораторные красители
    1. Альтернативные методы
  4. История гистологии
  5. Гистологическая классификация тканей животных
  6. Родственные науки
  7. Гистологические артефакты
    1. Гистологическое искусство

Подготовка образца

Подготовка гистологического образца состоит из нескольких этапов.

Фиксация

Для предотвращения разрушения ткани и сохранения структуры клеток и субклеточных компонентов, таких как клеточные органеллы (например, эндоплазматический ретикулум, ядро, митохондрии) используются химические фиксаторы. Наиболее распространенный фиксатор для световой микроскопии – это 10% нейтральный буферный формалин (4% формальдегид в фосфатном буферном растворе соли). В электронной микроскопии чаще всего используется такой фиксатор, как глутаральдегид, как правило, в форме 2,5% раствора в фосфатном буферном физиологическом растворе. Эти фиксаторы сохраняют ткани или клетки, в основном, посредством белков, образующих необратимые поперечные связи. Основным действием этих альдегидных фиксаторов является сшивка аминогрупп в белки путем образования метиленовых мостиков (-СН2-) в случае формальдегида, или с помощью сшивок C5H10 в случае глутаральдегида. В этом процессе, сохраняющем структурную целостность клеток и тканей, может повредиться биологическая функция белков, в частности ферментов, а также могут измениться их естественные свойства в определенной степени. Это может быть вредно для некоторых гистологических методов. Другие фиксаторы, часто используемые в электронной микроскопии, это осмия тетроксид или уранилацетат.

Фиксация формалином ведет к деградации мРНК, миРНК и ДНК в ткани. Тем не менее, анализ, экстракция и амплификация этих нуклеиновых кислот из зафиксированных в формалине, залитых в парафин тканей возможны с помощью соответствующих протоколов.

Заморозка – это быстрый способ зафиксировать и установить гистологические срезы. При использовании в хирургическом удалении опухоли с помощью этого метода можно быстро определить границы (подтверждая полное удаление опухоли). Для этого используется охлаждающее устройство, называемое криостатом. С помощью микротома разрезают замороженные ткани и помещают замороженные срезы на предметное стекло, и окрашивают так же, как в других методах. Кроме того, незафиксированные замороженные срезы можно использовать в исследованиях, в которых нужна локализация фермента в ткани и клетках. Это необходимо для фиксации ткани для определенного красителя, например, в иммунофлуоресцентном окрашивании, связанном с антителом. Его также можно использовать для определения злокачественности опухоли при ее случайном обнаружении во время операции на пациенте.

Обработка – дегидратация, очистка и инфильтрация

Цель обработки ткани заключается в удалении воды из тканей и замещении средой, которая затвердевает, чтобы нарезать тонкие срезы. Биологическую ткань следует поддерживать в жестком матриксе, чтобы позволить нарезку достаточно тонких срезов, как правило, толщиной 5 мкм в световой микроскопии и толщиной 80-100 нм в электронной микроскопии. Чаще всего в световой микроскопии используется парафин. Учитывая его неспособность смешиваться с водой, а это основной компонент биологической ткани, воду необходимо сначала удалить в процессе дегидратации. Для удаления воды образцы перемещаются через ванны с этанолом с постепенно нарастающей концентрацией. После этого следует обработка гидрофобным координационным агентом (например, ксилолом), чтобы удалить спирт, и, наконец, расплавленным парафином, агентом инфильтрации, заменяющим ксилол. При помощи парафина нельзя добиться достаточно жесткого матрикса для нарезки тончайших срезов в электронной микроскопии. Поэтому вместо него используются смолы. Чаще всего применяются эпоксидные смолы в качестве среды для заливки, но также используются и акриловые смолы, в частности, когда требуется иммуногистохимия. Для световой микроскопии также могут быть нарезаны более толстые срезы (0,35-5 мкм) ткани, залитой в смолу. Опять-таки, неспособность смешиваться с водой, которой отличается большинство эпоксидных и акриловых смол, приводит к необходимости дегидратации, как правило, с использованием этанола.

Заливка

После дегидратации, очищения и пропитки тканей материалом для заливки они готовы для внешней заливки. В этом процессе образцы тканей помещаются в формы с жидким материалом (например, агаром, желатином или воском). Материал затем затвердевает за счет охлаждения при использовании парафина и нагрева (выдержка) при использовании эпоксидных смол. Для полимеризации акриловых смол применяют тепло, ультрафиолетовый свет или химические катализаторы. Отвердевшие блоки, содержащие образцы тканей, затем готовы к нарезке срезов.

Так как зафиксированные формалином, залитые в парафин ткани могут храниться при комнатной температуре бесконечно, а нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК) можно восстановить из них спустя много лет после фиксации, такие ткани (FFPE) являются важным источником для исторических исследований в медицине.

Заливка также может быть выполнена с использованием замороженной, незафиксированной ткани в среде на основе воды. Ткани после предварительной заморозки помещаются в формы с жидким материалом заливки, как правило, гликолем на водной основе, TBS, OCT, криогелем или смолой, которые замораживаются для формирования отвердевших блоков.

Срез

Срез можно получить при помощи ограниченных способов. Обычным методом является вертикальный срез перпендикулярно к поверхности ткани. Зачастую в оценке волосяных фолликулов и сально-волосяных единиц делается горизонтальный срез. По направлению по касательной к горизонтальному срезу выполняется в методах CCPDMA и в хирургии Мооса.

В световой микроскопии для нарезки срезов ткани толщиной 4 мкм, которые расположены на предметном стекле микроскопа, используется стальной нож, установленный в микротоме. В просвечивающей электронной микроскопии для нарезки срезов ткани толщиной 50 нм, которые расположены на медной сетке диаметром 3 мм, используется алмазный нож, установленный в ультрамикротоме. Установленные срезы затем обрабатывают соответствующим красителем.

Залитую в замораживающую среду замороженную ткань нарезают на микротоме в охлажденной машине (криостат). Для обеспечения толщины 1-10 мкм следует использовать только микротом.

Окрашивание

Биологическая ткань отличается небольшим присущим контрастом под светом или электронным микроскопом. Чтобы придать ткани контраст, а также выделить представляющие интерес особенности, применяется окрашивание. Термин «гистохимия» используется там, где понимается основная механистическая химия окрашивания. В гистологии и гистопатологии чаще всего используется окрашивание гематоксилином и эозином в качестве светового микроскопического красителя. Под действием гематоксилина, основного красителя, ядра окрашиваются в синий цвет из-за близости к нуклеиновым кислотам в клеточном ядре; эозин, кислотный краситель окрашивает цитоплазму в розовый цвет. Чтобы придать ткани контраст в электронной микроскопии, обычно используют уранилацетат и цитрат свинца.

Кроме того, разработаны многочисленные методы с целью избирательного окрашивания клеток и их компонентов. Одним из основных примеров практического использования является маркировка периферийных опухолей или хирургического края. В этом методе разные цвета красителя применяются к разным границам образца, помогая выявить местоположение опухоли или какой-либо другой патологии в нем. Другие соединения, используемые для окрашивания срезов тканей, включают сафранин, масляный красный О, конго красный, соли серебра, прочный зеленый FCF и множество натуральных и искусственных красителей, происходящих, как правило, от красителей, используемых для обработки текстильной промышленности.

Гистохимия – это наука, использующая химические реакции между лабораторными химическими веществами и компонентами в ткани. Обычно выполняется такая гистохимическая техника, как окраска по Перлсу, помогающая продемонстрировать отложения железа в случае таких заболеваний, как гемохроматоз.

Зачастую образцы гистологии исследуются при помощи радиоактивных методов. В гисторентгенографии рентгеном обрабатывается слайд (иногда гистохимически окрашенный). Авторадиография используется чаще всего для визуализации места, к которому было перемещено радиоактивное вещество в организме, например, клетки в S-фазе (проходящие репликацию ДНК), соединяющиеся с меченным тритием тимидином, или участки, к которым привязываются зонды радиоактивных нуклеиновых кислот в месте гибридизации. Обычно в авторадиографии на микроскопическом уровне слайд погружают в жидкую эмульсию ядерного тракта, которая высыхает, образуя пленку экспозиции. Отдельные сердцевинные лучи в пленке визуализируют с помощью темнопольной микроскопии.

Недавно для конкретной визуализации белков, углеводов и жиров были использованы антитела. Этот процесс называется иммуногистохимия, или при окрашивании флуоресцентной молекулой – иммунофлюоресценция. Этот метод значительно повышает возможность определить под микроскопом категории клеток. Можно объединить другие дополнительные техники, такие как нерадиоактивная локализованная гибридизация, с иммунохимией с целью определения конкретных молекул ДНК или РНК посредством флуоресцентных зондов или меток, потенциально используемых для иммунофлуоресцентной и фермент-связанной флуоресцентной амплификации (особенно щелочная фосфатаза и тирамидная сигнальная амплификация). Люминесцентная микроскопия и конфокальная микроскопия используются для обнаружения флуоресцентных сигналов с хорошей внутриклеточной детализацией. Все чаще используются цифровые фотоаппараты для захвата гистологических и гистопатологических изображений.

Видео о гистологии

Распространенные лабораторные красители

Краситель

Обычное использование

Цитоплазмы

Ядро

Волокна коллагена

Красные кровяные тельца (RBC)

Конкретное окрашивание

Гематоксилин

Общее окрашивание при объединении с эозином (например, Г+Э)

Синий /Коричневый/Черный

Оранжевый, Голубой или Зеленый

Нет данных

Нет данных

Нуклеиновые кислоты – синий

Эндоплазматическая сеть – синий

Эозин

Общее окрашивание при объединении с гематоксилином (например, Г+Э)

Розовый

Нет данных

Розовый

Оранжевый/красный

Эластичные волокна – розовый

Волокна коллагена – розовый

Ретикулярные волокна – розовый

Толуидиновый синий

Общее окрашивание

Синий

Синий

Синий

Синий

Гранулы тучных клеток – пурпурный

Трехцветный краситель Мэссона

Соединительная ткань

Красный/Розовый

Черный

Синий /зеленый

Красный

Хрящ – синий/зеленый

Мышечные волокна – красный

Трехцветный краситель Маллори

Соединительная ткань

Бледно-красный

Красный

Темно-синий

Оранжевый

Кератин – оранжевый

Хрящ – синий

Костный матрикс – темно-синий

Мышечные волокна – красный

Эластичный краситель Вейгерта

Эластичные волокна

Нет данных

Синий/черный

Нет данных

Нет данных

Эластичные волокна – синий/черный

Трехцветный краситель Азан Гейденгойна

Отличие клеток от внеклеточных компонентов

Розовый

Красный/пурпурный

Синий

Красный

Мышечные волокна – красный

Хрящ – синий

Костный матрикс – синий

Серебрянка

Ретикулярные волокна, нервные волокна, грибки

Нет данных

Нет данных

Нет данных

Нет данных

Ретикулярные волокна – черный/коричневый

Нервные волокна– коричневый/черный

Грибки – черный

Краситель Райта

Клетки крови

Синеватый/серый

Синеватый/пурпурный

Нет данных

Красный/Розовый

Гранулы нейтрофилов – пурпурный/розовый

Гранулы эозинофилов – ярко-красный/оранжевый

Гранулы базофилов – пурпурный/фиолетовый

Гранулы тромбоцитов – красный/пурпурный

Орсеиновый краситель

Эластичные волокна

Нет данных

Темно-синий

Розовый

Ярко-красный

Эластичные волокна – темно-коричневый

Гранулы тучных клеток – пурпурный

Гладкие мышцы – светло-синий

Перйодная килоста – краситель Шиффа (PAS)

Базальная мембрана, локализующая углеводы

Нет данных

Синий

Розовый

Нет данных

Гликоген и другие углеводы – фуксиновый

Для определения нейронов эффективны методы Нисслю и Гольджи.

Альтернативные методы

Среди альтернативных методов – криосрез, в котором ткань замораживается, используя криостат, и разрезается. Способы окрашивания тканей аналогичны подготовке восковых срезов. Обычно в электронной микроскопии в подготовке материала используется заливка в пластик. Ткани заливаются в эпоксидную смолу. Для нарезки очень тонких срезов (менее 0,1 мкм) используют алмазные или стеклянные ножи. Срезы окрашиваются плотными электронными красителями (уран и свинец), чтобы можно было рассмотреть их под электронным микроскопом.

История гистологии

В XIX в. гистология была академической дисциплиной. В 1906 г. гистологи Камилло Гольджи и Сантьяго Рамон-и-Кахаль получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине. Они соревновались в интерпретации нейронной структуры мозга на основе различных толкований одних и тех же изображений. Кахаль выиграл приз за его правильную теорию, а Гольджи – за изобретенную технику окрашивания, которая сделала это возможным.

Гистологическая классификация тканей животных

Существуют четыре основных типа тканей: мышечная, нервная, соединительная и эпителиальная. Подтипами этих основных типов служат все типы тканей (например, клетки крови классифицируются как соединительная ткань, так как они, как правило, возникают внутри костного мозга).

  • Эндотелий: выстилающий слой кровеносных и лимфатических сосудов.
  • Эпителий: выстилающий слой желез, кишечника, кожи и некоторых органов, таких как легкие, печень и почки.
  • Мезотелий: выстилающий слой плеврального и перикардиального пространства.
  • Мезенхима: клетки, заполняющие пространство между органами, в том числе жир, мышцы, кости, хрящи, сухожилия и клетки.
  • Клетки крови: белые и красные кровяные тельца, включая те, что находятся в лимфоузлах и селезенке.
  • Половые клетки: клетки репродуктивной системы (сперматозоиды у мужчин, ооциты у женщин)
  • Нейроны: любая из проводящих клеток нервной системы.
  • Стволовые клетки: клетки, способные развиваться в разнообразные типы клеток.
  • Плацента: орган, характерный для истинных млекопитающих в период беременности, соединяющий мать и потомка, обеспечивая внутреннюю секрецию и селективный обмен растворимых, но не частичных веществ, переносимых с кровью, через присоединение матки и трофобластических наполненных сосудами частей.

Гистологическому исследованию можно подвергнуть и ткани растений, микроорганизмов и грибов. По своей структуре они значительно отличаются от тканей животных.

гистология

Родственные науки

  • Анатомия – это исследование органов, видимых невооруженным глазом.
  • Клеточная биология – изучение живых клеток, их ДНК и РНК и экспрессируемых ими белков.
  • Морфология – изучение всего организма.
  • Цитология – это микроскопическое исследование свободных клеток или кластеров, полученных при помощи взятия образцов телесных выделений, аспирации, соскоба, мазка или смыва.

Гистологические артефакты

Гистологическими артефактами называются тканевые структуры и функции, мешающие нормальной гистологической экспертизе. В нормальной ткани они присутствуют не всегда и могут исходить из источников извне. Артефакты мешают гистологии путем изменения внешнего вида тканей и скрытия структуры. Их можно разбить на две категории:

  • Предгистологические особенности и структуры, введенные до сбора тканей. Распространенные примеры – чернила из татуировок и веснушки (меланин) в образцах кожи.
  • Постгистологические – артефакты могут появиться, как результат обработки ткани. Обычно обработка приводит к некоторым изменениям, таким как усадка, вымывание отдельных клеточных компонентов, изменение цвета в различных видах тканей и изменения их структуры. Поскольку они возникают в лабораторных условиях, большинство постгистологических артефактов можно избежать или удалить после обнаружения. Типичным примером является использование ртутного пигмента после фиксатора Ценкеровского для фиксации среза.

Гистологическое искусство

Нормальный рисунок тканей и артефактов, являющийся результатом процесса подготовки тканей, гарантирует уникальность каждого гистологического среза. Как часть биологического искусства, эти изображения обеспечивают глубокое проникновение в организацию и функционирование нашего организма. Гистологические структуры, которые выглядят как повседневные предметы или свойства, появляются в социальных и научных сообществах и даже в гистопатологических журнальных статьях. Гистология – это научная область, где сталкиваются искусство и наука. Таким образом, гистологию может оценить не только предметно-ориентированный патологоанатом, но и любящие искусство непрофессионалы. Все это делает гистологию и патологию более доступными и менее сложными в качестве комплексных наук.




© Авторы и рецензенты: редакционный коллектив оздоровительного портала "На здоровье!". Все права защищены.


 
Текст сообщения*
Защита от автоматических сообщений
Загрузить изображение
 

nazdor.ru
На здоровье!
Беременность | Лечение | Энциклопедия | Статьи | Врачи и клиники | Сообщество


О проекте Карта сайта β На здоровье! © 2008—2017 
nazdor.ru, nazdor.com
Контакты Наш устав

Рекомендации и мнения, опубликованные на сайте, являются справочными или популярными и предоставляются широкому кругу читателей для обсуждения. Указанная информация не заменяет квалифицированную медицинскую помощь, основанную на истории болезни и результатах диагностики. Обязательно проконсультируйтесь с врачом.

Размещенные на сайте информационные материалы, включая статьи, могут содержать информацию, предназначенную для пользователей старше 18 лет согласно Федеральному закону №436-ФЗ от 29.12.2010 года "О защите детей от информации, причиняющей вред их здоровью и развитию".