Пользовательский поиск

Анализ на хламидии методом ПЦР

Новый метод ПЦР в режиме реального времени для выявления вируса хламидии трахоматис при помощи анализа утренней мочи или мазков с половых органов.

Продолжение ниже

Анализы на ИППП (инфекции, передающиеся половым путём) методом ПЦР и другими

Уместна ПЦР на гонорею, но она не позволяет сделать анализ на чувствительность к антибиотикам. Предпочтительно сделать ... ... относят хронические воспалительные заболевания органов таза, вызванные хламидиями, которые повышают риск внематочной беременности и бесплодия....

Читать дальше...

всё на эту тему


Выявление инфекций хламидии трахоматис может проводиться при помощи образцов мочи или мазков с половых органов, используя молекулярные методы. Был разработан новый подход, который совмещает автоматизированную процедуру экстракции, автоматизированную систему обработки жидкостей и ПЦР в реальном времени для выявления хламидии трахоматис в моче или мазках. Этот новый метод ПЦР в режиме реального времени сравнили с коммерческой системой Cobas Amplicor на 628 видах. В ретроспективном анализе 51 образец, которые имели положительный результат, используя способ Cobas, имели также положительные результаты с методом ПЦР в реальном времени, тогда как 49 образцов, имевшие отрицательный результат с Cobas, были также отрицательны с методом ПЦР в реальном времени. Среди 528 следующих образцов, последовательно полученных лабораторией с запросом на выявление хламидии трахоматис методом ПЦР, пять реакций ПЦР были ингибированы при тестировании с Cobas. Эти пять ингибированных образцов показали отрицательный результат с методом ПЦР в реальном времени. Среди оставшихся 523 образцов, 45 (8,6 %) были положительными при анализе обоими методами, 476 (91 %) были отрицательными при анализе обоими методами, и 2 (0,4%) были положительными при анализе Cobas, но отрицательными при анализе ПЦР в реальном времени. Таким образом, рассматривая Cobas как золотой стандарт, одинаковый результат методов составил 99,6%, чувствительность метода ПЦР в реальном времени составила 95,7%, а специфичность - 100%. Два несоответствующих образца были повторно проверены параллельно и были сочтены отрицательными обоими методами. Проверяя партию из 25 образцов, затраты на реактивы и время лаборантов были уменьшены с новым методом ПЦР (7,30 евро за образец и 134 минуты) по сравнению с Cobas (11,20 евро за образец и 232 минуты). Кроме того, из-за уменьшенных организационных ограничений, среднее время от приема образцов до получения результата составило всего 24 часа, используя автоматизированную платформу. В целом, этот новый подход ПЦР в реальном времени показал превосходную специфичность и чувствительность, подобную характеристикам Cobas Amplicor ПЦР для обнаружения хламидии трахоматис. Учитывая его высокий потенциал пропускной способности и низкую стоимость/затраченное время лаборантов, он может быть полезным для будущего использования в крупных программах сдачи анализов на хламидии трахоматис.

Общие сведения об анализе на хламидии методом ПЦР

Инфекции, вызванные хламидией трахоматис, являются наиболее распространенными бактериальными заболеваниями, передающимися половым путем в Европе, где среди здоровых женщин было зарегистрировано высокое распространение инфекций. Инфекции хламидии трахоматис могут вызвать уретрит, цервицит и воспалительное заболевание тазовых органов у женщин. Более 50% инфекций хламидии трахоматис бессимптомны, и поэтому они могут остаться необнаруженными, и таким образом невылеченными, в течение длительного периода времени. Невылеченная инфекция хламидии трахоматис может быть связана с серьезными долгосрочными осложнениями, такими как внематочной беременностью и бесплодием. Эту инфекцию можно достоверно диагностировать и, в несложных случаях, можно вылечить одной дозой азитромицина. Таким образом, важно выявлять людей с инфекциями хламидии трахоматис. Однако, на протяжении многих лет, высокая стоимость и большое количество затрачиваемого времени, связанные с обычными диагностическими подходами, предотвратили их применение во многих микробиологических лабораториях.

Методы амплификации нуклеиновой кислоты все больше используются для диагностики хламидийных инфекций. В дополнение к шеечно-влагалищным и уретральным мазкам, к образцам мочи могут быть применены методы амплификации ДНК, и это связано с более частым проведением программ диагностики хламидии трахоматис среди людей, у окторых не проявляются симптомы болезни.

Amplicor ПЦР тест, разработанный компанией Roche Diagnostics, для обнаружения ДНК хламидии трахоматис, был первым молекулярным тестом на хламидию трахоматис, одобренным управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США, и многие исследования засвидетельствовали его надежность. Cobas Amplicor (Roche) в настоящее время является наиболее широко используемой системой в Швейцарии. Другие системы, такие как APTIMA Combo 2, использующая транскрипционно-опосредованную амплификацию, BDProbeTec (Becton Dickinson Diagnostics) использующая амплификацию с замещением цепей, и Abbott ПЦР в реальном времени также в настоящее время применяются в Европе для обнаружения ДНК хламидии трахоматис. Однако, эти системы остаются дорогими и не полностью автоматизированными. С другой стороны, было описано большое количество внутренних молекулярных тестов на обнаружение хламидии трахоматис. Все эти внутрифирменные тесты проводятся вручную, основаны на геле и используют открытые системы с отдельными процедурами для амплификации и анализа ампликона. Из-за риска загрязнения и недостатка автоматизации, эти испытания не подходят для диагностических лабораторий с высокой рабочей нагрузкой.

В последние годы ПЦР в реальном времени используется все больше, т.к. он легче в исполнении и быстрее и, т.к. он выполняется в закрытой системе, менее склонной к загрязнению, чем обычный метод ПЦР. Понятие платформы было создано в молекулярной диагностической лаборатории для обнаружения нуклеиновой кислоты во многих различных болезнетворных микроорганизмах. ПЦР в реальном времени (TaqMan technology, ABI 7900, Applied Biosystems) был объединен с автоматизированным методом извлечения ДНК (MagNA Pure, Roche) и автоматизированной пипеточной системой (Tecan EVO 150, Tecan Trading). Это позволило обработать большое количество экземпляров в 384–луночных планшетах при помощи почти полностью автоматизированной процедуры с низкими затратами времени лаборантов.

Цели исследования были следующие.

  1. Развить подход ПЦР, которым можно было бы управлять на автоматизированной платформе. Такое понятие платформы связано с быстрым сроком выполнения работы, низкой стоимостью, небольшим количеством затраченного времени и гибкостью, т.к. возможно выявлять другие бактерии и вирусы в ходе этой же процедуры.
  2. Сравнить этот современный подход ПЦР с обычной коммерческой системой обнаружения ПЦР Cobas Amplicor (Roche).

Методы анализа на хламидии

Образцы

В общей сложности диагностической лаборатории было представлено 628 экземпляров для обнаружения ДНК хламидии трахоматис. Образцы включали 281 цервикальных или вагинальных мазков и 347 образцов мочи, взятых у 562 пациентов (389 женщин и 173 мужчины). Среди этих 628 экземпляров 100 экземпляров, приблизительно 50% из которых были положительными, были проверены ретроспективно, и 528 образцов были собраны постепенно (с марта до августа 2005 года). Все образцы были протестированы Cobas Amplicor и методом ПЦР в реальном времени.

Чтобы сравнить время от приема образца до получения результата в молекулярной диагностической лаборатории, мы извлекли из автоматизированной системы эти две точки времени для двух наборов 100 последовательных образцов, обычно анализированных во время двух сопоставимых периодов (весна 2005 года для Cobas Amplicor и весна 2006 года для ПЦР в реальном времени).

Метод Cobas Amplicor для выявления хламидии трахоматис

Образцы мазков были собраны, транспортированы в лабораторию при комнатной температуре в транспортной среде транспортного комплекта Amplicor (Roche) и обработаны согласно инструкциям производителя Cobas Amplicor. Затем они были заморожены до температуры −20° C до дальнейшего использования, или ДНК было непосредственно извлечено с помощью MagNA Pure (Roche). Образцы мочи были собраны в стерильные контейнеры, транспортируемые при комнатной температуре, и 10 мл было центрифугировано в течение 20 минут. Надосадочная жидкость была удалена, и осадок был обработан согласно инструкциям производителя (Amplicor CT/NG комплект подготовки экземпляров). Осадок был заморожен до температуры −20°C до дальнейшего использования, или ДНК была непосредственно извлечена при помощи MagNA Pure.

ПЦР амплификация и обнаружение положительных образцов были выполнены, используя автоматизированную систему Cobas Amplicor, как было рекомендовано изготовителем. Регуляция ингибирования (плазмида, содержащая последовательности, использованные для амплификации хламидии трахоматис), всегда поддерживалась параллельно для каждого образца, чтобы гарантировать обоснованность каждого отрицательного результата.

Извлечение ДНК для теста ПЦР в реальном времени

Используя автоматизированную систему MagNA Pure LC (Roche) и комплект извлечения ДНК MagNA Pure LC I (Roche), ДНК была извлечена из 200 т/л таявших или свежих образцов мазков, содержащихся в транспортной среде или из 200 т/л аликвоты осадка из 10 мл центрифугируемой мочи. Затем ДНК была элюирована в заключительном объеме 100 т/л элюирующего буфера, предоставленного в комплекте. Была проверена одна отрицательная регуляция экстракционного реагента при каждой процедуре извлечения (32 – луночный планшет).

Метод ПЦР в реальном времени

Праймеры и образцы были отобраны из последовательностей криптической плазмиды (образцы GenBank № M19487, Y00505, J03321, X06707 и X07547) пяти различных цепочек хламидии трахоматис (серотипы A, B, D, L1 и L2, соответственно) и спроектированы, используя программное обеспечение Primer Express (Applied Biosystems). Были отобраны прямой праймер Ctr_F (5 ′-CATGAAAACTCGTTCCGAAATAGAA-3 ′), обратный праймер Ctr_R (5 ′-TCAGAGCTTTACCTAACAACGCATA-3 ′) (который усиливают сегмент 71 пары оснований ДНК хламидии трахоматис) и образец белка, связывающийся с малой бороздой, маркированный 5′FAM (6-карбодиофлюоресцеин) Ctr_P (5 ′-TCGCATGCAAGATATCGA-3 ′). Было установлено, что температура плавления образца должна быть на 10–11° C выше, чем температура соответствующих праймеров, чтобы гарантировать скрещивание образцов во время расширения праймеров. Праймеры были подготовлены Eurogentec, а образцы - Applied Biosystems.

Реакции были выполнены в заключительном объеме 20 т/л, включая 0,2 мкм каждого праймера, 0,1 мкм образца Ctr_P , 10 т/л 2× TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems) и 5 т/л образцов ДНК. Циклические условия продолжались 2 минуты при температуре 50° C, 10 минут при температуре 95° C, за которыми следовали 45 циклов по 15 секунд при температуре 95° C и 1 минута при температуре 60° C. Амплификация и обнаружение продукта ПЦР были выполнены с помощью ABI Prism 7900 Sequence Detection system (Applied Biosystems).

Автоматизированная система обработки жидкости (Tecan Freedom EVO 150, 8 tips, Tecan Trading), которая позволяет подготовку 384–луночных планшетов с высокой точностью, была объединена с автоматизированной системой обнаружения последовательности ABI 7900. Каждый образец был амплифицирован в двойном экземпляре. Ингибирующая регуляция была проверена для каждого образца. Эта регуляция была получена, путем добавления к 15 т/л основной смеси ПЦР 4 т/л образца ДНК и 1 т/л, содержащего 20 копий плазмиды позитивной регуляции. Отрицательная регуляция, начиная от процедуры извлечения, была включена для каждой процедуры извлечения, и три дополнительных средства регуляции без шаблонов были добавлены для каждой процедуры амплификации.

Позитивная регуляция

Первоначально, люди использовали промышленную позитивную регуляцию (Bio-Rad Amplichek CT/GC Controls). Для облегчения подсчета молекул была построена плазмида, содержащая целевой ген. ДНК был извлечен из хламидии трахоматис с позитивной регуляцией, и целевая последовательность была усилена праймерами CTr_F и CTr_R. Конечная реакционная смесь в 50 т/л содержала 0,4 мкм каждого праймера, 1,25 полимераза ДНК AmpliTaq Gold т/л−1 (Applied Biosystems), 5 т/л 10× буферного раствора ПЦР, содержащего 20 ммоль Tris/HCl, 100 ммоль KCl, 3 ммоль MgCl2, 0,02% желатина , 400 мкм dNTPs (Microsynth) и 5 т/л ДНК хламидии трахоматис. ПЦР был выполнен в системе GeneAMP PCR 9700 (Applied Biosystems) согласно следующей процедуре: 2 минуты при температуре 50° C, 10 минут при температуре 95° C, 50 циклов при температуре 95° C по 15 секунд, 1 минута при температуре 60° C, 30 секунд при температуре 72° C. Затем продукты ПЦР были очищены при помощи комплекта очистки QIAquick (Qiagen) и клонировали в pCRR 2.1-TOPO векторе (Invitrogen) согласно протоколу изготовителя. Изоляция рекомбинантной ДНК плазмиды была выполнена с QIAprep Miniprep (Qiagen), и присутствие правильной вставки было подтверждено упорядочиванием. Затем плазмида была посчитана спектрофотометрическим образом (GeneQuant pro RNA/DNA calculator, Amersham Pharmacia Biotech). Эти позитивные регуляции были разбавлены и стабилизированы добавлением человеческой геномной ДНК (10 нг т/л−1; Roche) и сохранены при температуре −20° C. По крайней мере, три позитивные регуляции, соответствующие 100, 10 и одной копии ДНК были включены в каждую процедуру. Изменчивость между процедурами была оценена, основываясь на результатах, полученных из 60 последовательных процедур.

Интерпретация TaqMan ПЦР в реальном времени

Во время амплификации краситель репортер был измерен по отношению к сигналу пассивного референсного красителя, чтобы нормализовать колебания флюоресценции, не связанные с амплификацией ПЦР, и это может произойти с увеличением номера цикла. Положительный результат был определен путем определения порогового цикла, т. е. номера цикла, в котором нормализованная эмиссия красителя репортера была выше фонового шума. Если флуоресцентный сигнал не увеличивался в пределах 45 циклов, образец считали отрицательным.

Чтобы выполнить подсчет, была составлена стандартная кривая при помощи программного обеспечения Taqman от порогового цикла последовательных разбавлений известных количеств клонированных плазмид. Эти стандартные кривые были составлены, используя последовательные 10-кратные разбавления растворов плазмиды (в пределах от 100 до 1 плазмиды) и позволенное количество положительных образцов в копиях за пять мкл ДНК. Стандартная кривая также предоставила информацию об аналитической чувствительности и воспроизводимости ПЦР.

Амплификацию считали успешной для экземпляра, если ингибирующая регуляция ингибировала примерно одинаковый пороговый цикл Ct (±1) для 20 копий, как было определено из порогового цикла, полученного для 10-и 100 копий позитивной регуляции.

Экономический анализ

Чтобы сравнить стоимость нового метода ПЦР в реальном времени со стоимостью метода Cobas Amplicor, были приняты во внимание только прямые затраты, которые были извлечены из отчетов 2005 года. За модель была взята ситуация, в которой было проверено от 1 до 50 образцов в двойном экземпляре с тремя положительными и тремя отрицательными регуляциями за одну процедуру, одной ингибирующей регуляцией на один образец и одной негативной регуляцией извлечения за процедуру извлечения. В стоимость извлечения, распределения жидких реактивов и ПЦР амплификации включили реактивы, трубки и другой пластиковый материал.

Во второй модели стоимость времени, затраченного лаборантом, была также принята во внимание, предполагая, что 1 час соответствует приблизительно 38 евро (эта стоимость включает праздники и социальные выплаты). Наконец, с тех пор как несколько болезнетворных микроорганизмов могут быть извлечены в ходе одной процедуры MagNA Pure и обнаружены в ходе той же самой процедуры TaqMan, была создана еще одна экономическая модель. В этом так называемом «исправленном подходе платформы», полагали, что, даже если только один образец представлен для обнаружения ДНК хламидии трахоматис, процедура извлечения и процедура TaqMan будут выполнены из-за извлечения и/или амплификации дополнительных образцов, представленных в других диагностических целях. В анализе не была принята во внимание стоимость ABI 7900, Tecan EVO 150, MagNA Pure и Cobas Amplicor.

Результаты анализов и обсуждение

Аналитическая чувствительность и специфичность метода ПЦР в реальном времени

Плазмида, содержащая целевую последовательность, была сконструирована и использовалась в качестве позитивной регуляции. Чтобы определить аналитическую чувствительность ПЦР, параллельно действовали 10-кратные последовательные разбавления (от 1000 до 1 копии) положительной регуляции плазмиды вместе с системой Cobas Amplicor и новым методом ПЦР в реальном времени. Когда обнаружили, что Cobas Amplicor получил положительный результат, ПЦР в реальном времени также имел положительный результат. Таким образом, уровень чувствительности этих двух методов считается одинаковым. Многие исследователи использовали систему Cobas Amplicor, которая предназначается для криптической плазмиды. В других отчетах использовались обычные методы ПЦР, которые предназначаются для других генов. В хламидии трахоматис присутствуют 7-10 копий криптической плазмиды, и поэтому ПЦР, нацеленный на криптическую плазмиду должен быть более чувствительным, чем ПЦР нацеленный на ген MOMP или ген наружного белка мембраны и цистин-богатого, оба из которых присутствуют только в одной копии генома. Хотя, были описаны некоторые изоляты, которые испытывают недостаток в криптической плазмиде с риском приведения к ложно-отрицательным результатам, цепочки, лишенные плазмиды, относительно редки. Пряймеры и образцы создавались для обнаружения всех серотипов и для использования при температуре 60° C. Эта температура отжига была выбрана, чтобы приспособить анализ к платформе, которая может обнаружить другие микроорганизмы в ходе одной процедуры. Уровень чувствительности ПЦР в реальном времени составил одну копию за реакцию или 100 копий мл−1. Проверяя воспроизводимость этих результатов ПЦР, тестируя трипликаты 10-кратных разбавлений в пяти различных экспериментах, 100 и 80% копий были положительны для хламидии трахоматис при концентрации 10 и одна копия за реакцию, соответственно, показывая превосходную воспроизводимость с 10 копиями и совместимость со стохастическим распределением ДНК в одной копии за реакцию.

Амплификации не наблюдалось, при анализе методом ПЦР в реальном времени с человеческой геномной ДНК или с ДНК 20 различных микроорганизмов, связанных с хламидией трахоматис, или она могла присутствовать в мочеполовых образцах. Это указывает на высокую специфичность нового метода ПЦР в реальном времени.

Ретроспективный анализ

Чтобы проверить надежность нового метода ПЦР в реальном времени на клинических экземплярах, в общей сложности на 100 образцах, ранее проверенных Cobas Amplicor, они были вслепую проанализированы методом ПЦР в реальном времени. Эти образцы, собранные между августом 2003 года и августом 2005 года и взятые у 67 женщин и 32 мужчин, пополнили ряд положительных образцов (51 положительный образец при анализе Cobas Amplicor).

Эти 51 положительных образцов (22 мазка и 29 образцов мочи) были также положительными при анализе с помощью метода ПЦР в реальном времени. С другой стороны все 49 образцов, которые были отрицательны при анализе Cobas Amplicor (29 мазков и 20 образцов мочи) были также сочтены отрицательными при анализе методом ПЦР в реальном времени. Как было показано эффективной амплификацией всех маркированных экземпляров, ингибирования ПЦР в реальном времени не наблюдалось. Таким образом, ПЦР в реальном времени показал высокую чувствительность и превосходную специфичность.

Перспективный анализ

Из этих 528 образцов, полученных лабораторией во время 6-месячного предполагаемого периода исследования, 298 (56 %) были образцами мочи и 230 (44 %), были образцами мазков. Они были собраны у 323 женщин и 140 мужчин. Образцы были проверены параллельно вслепую с Cobas Amplicor и ПЦР в реальном времени. С Cobas Amplicor 476 экземпляров были сочтены отрицательными и 47 – положительными. Пятнадцать экземпляров, как обнаружилось, были ингибированы при первой процедуре. При повторном анализе через 24 часа, при температуре −20° C, один экземпляр был сочтен положительным, девять были сочтены отрицательными, и пять (0,9 %) остались ингибированными. Эти пять образцов были отрицательными при анализе методом ПЦР в реальном времени. Затем результаты обеих процедур сравнили. Распространенность положительности составила 8,9% (47/523) и 8,5% (45/528) с Cobas Amplicor и ПЦР в реальном времени, соответственно. В целом, 45 экземпляров (35 мочи и 10 мазков) были положительными и 476 экземпляров - отрицательными при анализе обоими методами. Таким образом, полное совпадение результатов составило 99,6%, чувствительность и специфичность ПЦР в реальном времени составили 95,7 и 100%, соответственно, рассматривая Cobas Amplicor как золотой стандарт. Два экземпляра (0,4 %), один образец мочи и один мазок, были положительными при анализе Cobas Amplicor, но отрицательными при анализе методом ПЦР в реальном времени. Эти два образца с несоответствующими результатами были повторно параллельно проверены и были сочтены отрицательными обоими методами, предполагая, что несовпадающие результаты соответствовали ложноположительным результатам Cobas Amplicor или стохастическому распределению ДНК в экземплярах с очень низким количеством ДНК хламидии трахоматис. Контаминация при переносе во время извлечения вряд ли объяснит эти несоответствия, т. к. все отрицательные регуляции извлечения были отрицательны.

Экономический анализ

Затраты на реактивы и другие материалы, используемые для анализа 25 мазков или мочи в одной процедуре для выявления хламидии трахоматис были уменьшены приблизительно на 35% при использовании системы ПЦР реального времени по сравнению с методом Cobas Amplicor (7,30 против 11,20 евро за образец). Кроме того на процедуру ушло 134 минуты (5,4 минуты на образец, т.е. 3,45 евро за образец) для 25 мазков, исследованных с помощью системы ПЦР в реальном времени (от извлечения ДНК к результатам), по сравнению с 232 минутами (9,27 минут на образец, т.е. 5,90 евро за образец) для системы Cobas Amplicor. Принимая во внимание стоимость реактивов, материалов и время, затраченное лаборантами, стоимость образца для партии из 25 образцов составляла 10,75 евро для системы ПЦР в реальном времени по сравнению с 17,10 евро для системы Cobas Amplicor. Таким образом, анализ 25 образцов в той же самой партии, используя автоматизированные процедуры извлечения, связанные с жидкой системой обработки и ПЦР в реальном времени, позволил снизить затраты на реактивы на 35% и на 42% снизить время работы лаборантов по сравнению с Cobas Amplicor.

Кроме того, из-за многосторонности молекулярной диагностической платформы и факта, что ДНК других болезнетворных микроорганизмов может быть извлечен и/или амплифицирован в ходе этой же процедуры, истинная стоимость системы ПЦР в реальном времени должна быть скорректирована с учетом стоимости материалов и времени, затраченного лаборантами, разделенных с исследованиями, проводимыми для выявления других болезнетворных микроорганизмов, и анализом в той же партии. Таким образом, стоимость анализа одного образца на присутствие ДНК хламидии трахоматис методом платформы на 60% ниже, чем методом Cobas Amplicor (12,70 против 32,15 евро за реактивы и материалы, 22,40 против 56,50 евро, принимая во внимание также затраты связанные со временем работы лаборантов).

Преимущества нового метода ПЦР в реальном времени

Горизонтальное и вертикальное и загрязнение ПЦР ампликонами - это важный недостаток ПЦР особенно, при обработке большого количества образцов. Это загрязнение может быть предотвращено при помощи закрытых систем, таких как LightCycler (Roche) и MyiQ (Bio-Rad). Однако, ABI 7900 имеет дополнительные преимущества: 384–луночные планшеты и совместимость с автоматизированной жидкой системой обработки (Tecan). Эта полностью автоматизированная система гарантирует безопасную обработку образца и эффективную подготовку к ПЦР и может быть идеальным инструментом для крупных программ сдачи анализов, учитывая ее потенциал высокой пропускной способности. Кроме того эта интегрированная система уменьшает время до получения результата из-за сокращения времени выполнения процедуры и возможности одновременного анализа для различных целей (например, других бактерий, вирусов, грибков и др.). Стоимость анализа одного образца, используя подход платформы, на 60% ниже, чем при использовании Cobas Amplicor и стоимость за образец остается прежней при обработке пяти или шести образов одновременно, и поэтому небольшие лаборатории предпочтут проверять наличие хламидии трахоматис только в партиях для дальнейшего уменьшения затрат. Хотя, это может увеличить время получения результатов. В молекулярной диагностической лаборатории результаты были доступны в промежутке между 24 и 30 часами при использовании автоматизированной молекулярной платформы и Cobas, соответственно. Таким образом, сокращенное время получения результатов является дополнительным преимуществом системы.

Метод ПЦР в реальном времени также является преимуществом обеспечения количественных результатов. Распределение числа копий ДНК хламидии трахоматис на пять мкл образца ДНК присутствует во всех 96 положительных образцах. 16% (15/96) положительных образцов ингибировало очень низкое положительное число копии (< 10 копий на пять мкл ДНК), демонстрируя потребность в высокой чувствительности для достоверного диагностирования инфекции хламидии трахоматис. В будущем эта количественная информация могла бы быть полезной для определения соответствия количества молекул микроорганизмов с серьезностью болезни. Однако, опубликованные исследования применимости количественных результатов в клинических условиях не являются действительно убедительными. Действительно, в некоторых исследованиях количество молекул хламидии трахоматис связано с цервикальной эктопией, слизисто-гнойным цервицитом и воспалением тазовых органов, тогда как в других недавних исследованиях, число молекул хламидии трахоматис не связано с возрастом пациента и не влияет на клинические симптомы. Одно из главных ограничений метода ПЦР - это, что, в отличие от коммерческих молекулярных испытаний, он обнаруживает только ДНК хламидии трахоматис. В будущем будет разработан метод ПЦР для нейсеррии гонореи, который сможет выявлять хламидию трахоматис и нейссерию гонореи одновременно.

Учитывая долгосрочные осложнения, связанные с часто бессимптомной мочеполовой хламидийной инфекцией, важно иметь специфический и чувствительный диагностический тест. В предыдущих исследованиях хламидии трахоматис тест Cobas Amplicor показал высокую чувствительность (90–100 %) и превосходную специфичность (98–100 %) на моче и эндоцерквиальных образцах. Однако, этот коммерческий метод довольно дорог, и не совместим с автоматизированной молекулярной платформой. Был развит очень специфичный количественный метод ПЦР в реальном времени для обнаружения хламидии трахоматис, чувствительность которого была эквивалентна чувствительности Cobas Amplicor. Эта система экономически более выгодна, чем другие коммерческие системы, основанные на нуклеиновой кислоте по следующим причинам. Благодаря использованию автоматизированной жидкой системы обработки возможна работа с объемами в 20 т/л , и в 384–луночными планшетами. Это уменьшает затраты, связанные с мастер-микс и материалами. Автоматизация (для извлечения, пипеточного метода и амплификации ПЦР) сильно уменьшает время работы лаборанта (т.е. затраты на зарплату). В настоящее время доступные коммерческие испытания не имеют такого уровня автоматизации.

В отсутствие подходящих вакцин усилия по предотвращению инфекций хламидии трахоматис и связанных с ней долгосрочных осложнений полагаются, главным образом, на образование, сдачу анализов и лечение. Основанный на эффективности и надежности, новый метод ПЦР в реальном времени с большой вероятностью внесет свой вклад в будущие крупномасштабные программы сдачи анализов на хламидии трахоматис.




© Авторы и рецензенты: редакционный коллектив оздоровительного портала "На здоровье!". Все права защищены.


 
Текст сообщения*
Защита от автоматических сообщений
Загрузить изображение
 

nazdor.ru
На здоровье!
Беременность | Лечение | Энциклопедия | Статьи | Врачи и клиники | Сообщество


О проектеКарта сайта β На здоровье! © 2008—2015
nazdor.ru, nazdor.com
Контакты Наш устав

Рекомендации и мнения, опубликованные на сайте, являются справочными или популярными и предоставляются широкому кругу читателей для обсуждения. Указанная информация не заменяет квалифицированную медицинскую помощь, основанную на истории болезни и результатах диагностики. Обязательно проконсультируйтесь с врачом.

Размещенные на сайте информационные материалы, включая статьи, могут содержать информацию, предназначенную для пользователей старше 18 лет согласно Федеральному закону №436-ФЗ от 29.12.2010 года "О защите детей от информации, причиняющей вред их здоровью и развитию".