Пользовательский поиск

Современные методы конструирования ферментов с необходимыми свойствами

Большое разнообразие реакций, катализируемых ферментами, доступность их как химических объектов, глубокое понимание механизмов действия ферментов и возможности варьирования их свойств, основанные на современных методах химической энзимологии, молекулярной биологии и генетической инжене­рии, позволяют использовать ферменты для решения многих задач промышленности, сельского хозяйства, экологии, медицины.

Продолжение ниже

Ферменты в нетрадиционных средах. Мицеллярная энзимология

Ферменты в естественных условиях работают в водной среде или на границе раздела фаз мембрана — водная среда. Развитие ме­тодов химической ...

Читать дальше...

всё на эту тему


Область химической энзимологии, направленная на решение многообразных практических задач, получила название инженер­ной энзимологии.

В рамках химической энзимологии были созданы разнообраз­ные методы, позволяющие существенным образом изменять струк­туру и свойства белковых молекул. Эти методы основаны как на возможностях химической модификации белка, так и на дости­жениях молекулярной биологии, генетической и белковой инже­нерии.

Химическая модификация

Белковая молекула как объект, об­ладающий большими химическими возможностями, может быть легко химически модифицирована. Как следствие, в прак­тике инженерной энзимологии используют разнообразные мето­ды и приемы, позволяющие изменить химическую природу тех или иных групп белка и придать ему новые свойства. Химическую модификацию белка используют для изменения заряда белковой молекулы, что позволяет варьировать электрофоретическую под­вижность белка и часто его устойчивость к тепловой денатурации. Химическая модификация бифункциональными химическими си­стемами, например диальдегидами, приводит к образованию внут­римолекулярных связей и позволяет изменить картину инактива­ции фермента. Те же бифункциональные реагенты могут быть ис­пользованы для иммобилизации фермента на различные носите­ли и превращения его в гетерогенный катализатор. Наконец, химическая модификация позволяет изменить отноше­ние белка к тем или иным растворителям. Например, гидрофобизация позволяет белкам проникать сквозь липидные мембраны. Ме­тодами химической модификации можно обеспечить возможность включения белков в мембраны и даже транслокации через мемб­раны. Так, водорастворимые ферменты трипсин и а-химотрипсин были модифицированы хлорангидридом стеариновой кислоты. Реакция модификации представляет собой ацилирование свобод­ных групп белка. При этом молекула белка существенно гидрофобизуется и приобретает мембранотропные свойства. Эксперимен­тально было показано, что модифицированные таким образом бел­ки способны проникать в мембранные системы и проходить через биологические мембраны. Данный подход обеспечивает возмож­ность доставки белковых (ферментных) лекарственных препара­тов в клетки-мишени.

Комбинаторные методы, генетическая и белковая инженерия, ме­тоды направленной эволюции

Традиционным методом модифи­кации структуры белка на клеточном уровне является неспеци­фический мутагенез с последующим отбором мутантов с необхо­димыми характеристиками для того или иного фермента. В послед­ние годы появились более направленные методы.

Детальное знание структуры ферментов, относительно простые процедуры выделения гена фермента, развитие методов генети­ческой инженерии белков обеспечили возможность су­щественной модификации ферментов с получением белков с но­выми свойствами. Используемые в этой области методы условно можно разделить на две группы:

  1. методы, основанные на статистической замене аминокис­лот с последующим отбором мутантов (комбинаторные методы);
  2. рациональные методы, использующие сведения о третич­ной структуре фермента и позволяющие направленно изменять те или иные фрагменты белковой молекулы.

Использование комбинаторных методов, основанных на созда­нии большого массива возможных вариантов структур, особенно эффективно в случае модификации ферментов на уровне гена. Суть подходов, получивших название направленной эволюции, за­ключается в проведении случайных замен на уровне генов с после­дующим отбором мутантных вариантов, отвечающих цели улуч­шения свойств фермента. Методы проведения случайной замены разнообразны. Они включают «перетасовку» фрагментов ДНК, уко­рачивание гена по отдельным фрагментам, наращивание цепи со случайными ошибками. Существенное развитие и применение на­шли методы генерации библиотеки ДНК с использованием поли­меразной цепной реакции с применением ДНК-полимераз с пони­женной точностью выбора нуклеотидтрифосфатов. В этом случае копию гена, подлежащего случайным изменениям, берут в качестве основы, используют случайный набор праймеров и ДНК-полимераз с пониженной точностью. Результатом полиме­разной цепной реакции является большой набор родственных молекул ДНК, содержащих значительное число мутаций.

Полученные в результате этих процедур библиотеки ДНК вво­дят в вектора, например плазмиды, и трансформируют библиоте­кой плазмид клетки. Последующий скрининг колоний по тому или иному признаку позволяет отобрать клетки, содержащие фер­менты с нужным свойством.

В качестве критерия отбора нужного клона могут быть выбраны термостабильность, изменение специфичности, т. е. сродства к дан­ному субстрату, изменение характера зависимости скорости реак­ции от показателя pH.

Отобранный ген и соответственно белок могут быть подверг­нуты повторному раунду мутагенеза и селекции, и тем самым мо­жет быть проведено дальнейшее улучшение характеристик фер­мента. Число ферментов, модифицированных методами направ­ленной эволюции, непрерывно увеличивается. Наиболее извест­ны работы, выполненные в этом направлении группой Ф. Арнольд.

Часто направленную эволюцию применяют для улучшения тер­мостабильности белков. Так, методами молекулярной эволюции с помощью случайного мутагенеза термостабильность бактериаль­ной протеазы — субтилизина была увеличена в 1200 раз. Этими же методами удалось получить фермент, способный проводить реак­цию в растворе, содержащем 85 % диметилформамида. В лаборато­рии Ф. Арнольд методология направленной эволюции была ис­пользована для улучшения экспрессии синей медьсодержащей оксидазы, лакказы Myceliophthorathermophilica в дрожжах. Уровень экспрессии каталитической активности фермента в дрож­жах удалось увеличить в 170 раз.

Методами направленной эволюции удается вмешаться в участ­ки активного центра, определяющие специфичность фермента. Одна из первых работ в этой области была выполнена в лаборато­рии В.Штемлера (1997 г.). Как известно, ферменты, гидролизу­ющие галактозиды, обладают побочной фукозидазной активно­стью. С использованием метода перетасовки ДНК удалось суще­ственно повлиять на соотношение р-галактозидазой и р-фукозидазной активностей.

Методами статистического мутагенеза и направленной эволю­ции можно изменять стереоселективность ферментативных реак­ций. Наиболее часто для разделения рацемических смесей исполь­зуют протеазы или липазы. В частности, для целей разделения рацематов жирных кислот был применен статистический мутаге­нез липазы из Pseudomonasaeroginosa. Фермент данного типа осу­ществляет расщепление я-нитрофен иловых эфиров 2-метилдеканоата с селективностью лишь 2 % в пользу S-конфигурации. Вве­дением мутаций с использованием ДНК-полимеразы с понижен­ной точностью в ген фермента удалось за 4 раунда селекции уве­личить энантиоселективность фермента до 80 %.

Рациональные подходы основаны на анализе трехмерной струк­туры белка с выявлением перспективных замен, способных суще­ственным образом повлиять на свойства активного центра фер­мента или белка в целом. В качестве примера можно привести ра­боты, выполненные В.Тишковым по изменению специфичности формиатдегидрогеназы. Фермент данного штамма катализирует реакцию окисления формиата, используя в качестве кофактора НАД+, и проявляет лишь следовую активность в присутствии НАД+. Выбор замены был определен необходимостью введения групп, компенсирующих заряд фосфата, и создания пространства для фосфатной группы. Проведение всего лишь одной замены позво­лило существенно уменьшить реакционную способность НАД+ и увеличить реакционную способность НАДФ+.

Таким образом, в настоящее время созданы многообразные ме­тоды направленного изменения свойств белковой молекулы, по­зволяющие существенно улучшить ее характеристики как катали­затора химической реакции. Эти методы включают как химиче­скую модификацию молекулы, так и направленную модифика­цию ее структуры с введением изменений в ген белка. Это, безус­ловно, открывает новые возможности применения ферментов и обеспечивает развитие инженерной энзимологии. Можно ожидать, что в ближайшем будущем появятся методы создания искусствен­ных ферментов, предназначенные для осуществления определен­ных реакций, даже тех, которых пока нет в природе.




© Авторы и рецензенты: редакционный коллектив оздоровительного портала "На здоровье!". Все права защищены.


 
Текст сообщения*
Защита от автоматических сообщений
Загрузить изображение
 

nazdor.ru
На здоровье!
Беременность | Лечение | Энциклопедия | Статьи | Врачи и клиники | Сообщество


О проекте Карта сайта β На здоровье! © 2008—2017 
nazdor.ru, nazdor.com
Контакты Наш устав

Рекомендации и мнения, опубликованные на сайте, являются справочными или популярными и предоставляются широкому кругу читателей для обсуждения. Указанная информация не заменяет квалифицированную медицинскую помощь, основанную на истории болезни и результатах диагностики. Обязательно проконсультируйтесь с врачом.

Размещенные на сайте информационные материалы, включая статьи, могут содержать информацию, предназначенную для пользователей старше 18 лет согласно Федеральному закону №436-ФЗ от 29.12.2010 года "О защите детей от информации, причиняющей вред их здоровью и развитию".