Пользовательский поиск

Оптимизация экспрессии и выделение генно-инженерных белков

Подбор вектора, обеспечивающего высокоэффективную ре­пликацию генетической информации, соответствующего промо­тора, обеспечивающего интенсивный процесс транскрипции с синтезом соответствующей мРНК, и клетки-хозяина с развитым рибосомальным аппаратом дает возможность получить исключи­тельно высокие концентрации искомого белка или фермента. Так, в ряде случаев удается до 10—15% всего белка клетки иметь в форме генно-инженерного белка.

Продолжение ниже

Рудольф Хаушка: феномен белка

Типичная субстанция телесного строения животного – белок – так же характерна для животного, как для растения углеводы. Но и растение на определенном этапе развития образует белок, а именно,...

Читать дальше...

всё на эту тему


Трудности, которые в ряде случаев предстоит преодолевать исследователю, заключаются в том, что биосинтез целевого белка идет так быстро и концентрации получаемого белка настолько высоки, что белок не успевает пройти стадию образования вто­ричной и третичной структуры (фолдинга) и может агрегировать, образуя неструктурированные комплексы между полипептидными цепями. Эти агрегаты образуют собственную фазу и называют­ся тельцами включения. В тельцах включения белки не имеют сфор­мированной структуры и поэтому не обладают физиологической активностью, а ферменты не образуют активные центры и не об­ладают ферментативной активностью. Разработано несколько под­ходов, позволяющих управлять процессом.

Рефолдинг. Можно осуществить процесс рефолдинга белка. С этой целью белки телец включения помещают в растворы, разрушающие неспецифические комплексы полипептидных цепей, прежде всего разрушающие водородные и гидрофобные связи. Это могут быть добавки органических растворителей, мочевины или хлори­да гуанидина. Затем мягким удалением денатурирующего агента добиваются рефолдинга молекулы, т.е. образования необходимой вторичной и третичной структуры.

Использование шаперонов. В клетках хозяина имеются специаль­ные белки — шапероны, ответственные за исправление ошибок сворачивания полипептидной цепи. Это большие белковые обра­зования, способные за счет водородных, гидрофобных и ионных связей разрушить комплексы полипептидных цепей и, пропустив их сквозь себя, создать необходимую вторичную структуру.

Полученные генно-инженерные белки выделяют из клетки тра­диционными для биохимии и биотехнологии методами (осажде­ние, хроматография, электрофорез, аффинная хроматография). Методология генетической инженерии внесла свой вклад и в эту область. В последнее время стал распространенным метод включе­ния в ген целевого белка участка, позволяющего провести аффин­ную хроматографию. Например, присоединение к N- или С-концу белка полигистидинового участка позволяет провести высоко­эффективную очистку белка в одну стадию с использованием но­сителя на основе ионов никеля.

Сайт-направленный мутагенез

Особую роль в химии ферментов играет метод сайт-специфического (сайт-направленного) мутагенеза. Метод позволяет заме­нить одну аминокислоту в полипептидной цепи на любую другую из 20 природных аминокислот. Этим методом получена исключи­тельно важная информация о роли той или иной аминокислоты в катализе.

Существуют несколько подходов, позволяющих провести сайт-направленную замену аминокислоты. Наибольшее распростране­ние получил метод, основанный на замене аминокислоты в прай­мере для ДНК-полимеразы. В качестве основы вектора используют двухцепочечную форму ДНК фага М13. В данном случае используется способность двухцепочечных рекомбинантных ДНК на основе фага М13 пре­вращаться в одноцепочечные ДНК в фаговых частицах.

Образование зрелых частиц фага приводит к возникновению одноцепочечных кольцевых молекул ДНК (плюс-цепь) (стадия I). На стадии II происходит синтез минус-цепи с измененной одной аминокислотой, кодон которой вводится в виде праймера, содер­жащего кодон замещенной аминокислоты. На стадии III образует­ся замкнутая репликативная форма, содержащая запланирован­ную мутацию. Последующее введение полученного вектора в бак­териальную клетку позволяет получить кольцевую ДНК, несущую мутацию на выбранном участке гена (стадия IV).

Зрелые частицы фага содержат одноцепочечную кольцевую нить, которую можно достроить до двухцепочечной, используя в качестве праймера ДНК-полимеразы полинуклеотид с заменой кодона одной аминокислоты на кодон другой аминокислоты.

Первая стадия процесса — получение одноцепочечной формы ДНК фага М13. ДНК получается в форме плюс-цепи. С помощью ДНК-полимеразы минус-цепь может быть достроена до кольце­вой молекулы. Если в качестве праймера (стадия «отжига») будет использован полинуклеотид с заменой одного кодона на другой, продуктом реакции полимеризации будет кольцевая ДНК со спе­цифической заменой целевой аминокислоты. Двухцепочечную ДНК вводят в бактериальные клетки, которые производят плюс-цепь с запланированной мутацией. Экспрессия полученного фагового вектора приводит к появлению белка с локальной (направлен­ной, специфической) заменой одной аминокислоты на другую.

В последнее время широкое распространение получил метод сайт-направленного мутагенеза с использованием полимеразной цепной реакции. Суть метода заключается в том, что для полиме­разной реакции используются праймеры, содержащие одну или несколько нуклеотидных замен, приводящих к замене соответ­ствующего кодона в гене. Продуктом амплификации с использо­ванием таких праймеров является фрагмент гена, содержащий замену кодона (аминокислотную замену в белке) в строго опре­деленном положении. Полноразмерный ген собирается методами лигирования.

Генетическая инженерия — это шаг вперед в развитии хими­ческой энзимологии. Методы генетической инженерии сделали до­ступными для ученых большинство белков и ферментов, которые ранее выделяли из органов и тканей человека. Полученные мето­дами генетической инженерии и сайт-направленного мутагенеза, белки являются новыми искусственными образованиями, не име­ющими аналогов в природе. Это позволяет получать белки с но­выми свойствами. Сайт-направленный мутагенез дает возможность определить роль каждой аминокислоты в каталитическом акте. Данный подход позволяет изменить структуру активного центра, оптимизировать кинетические параметры реакции по тому или иному субстрату, тем самым направленно изменить специфич­ность фермента, его стабильность, устойчивость к денатуриру­ющим агентам. Все это обеспечивает условия для создания каче­ственно новых биокатализаторов и биокаталитических систем.




© Авторы и рецензенты: редакционный коллектив оздоровительного портала "На здоровье!". Все права защищены.


 
Текст сообщения*
Защита от автоматических сообщений
Загрузить изображение
 

nazdor.ru
На здоровье!
Беременность | Лечение | Энциклопедия | Статьи | Врачи и клиники | Сообщество


О проектеКарта сайта β На здоровье! © 2008—2015
nazdor.ru, nazdor.com
Контакты Наш устав

Рекомендации и мнения, опубликованные на сайте, являются справочными или популярными и предоставляются широкому кругу читателей для обсуждения. Указанная информация не заменяет квалифицированную медицинскую помощь, основанную на истории болезни и результатах диагностики. Обязательно проконсультируйтесь с врачом.

Размещенные на сайте информационные материалы, включая статьи, могут содержать информацию, предназначенную для пользователей старше 18 лет согласно Федеральному закону №436-ФЗ от 29.12.2010 года "О защите детей от информации, причиняющей вред их здоровью и развитию".