Пользовательский поиск

РНК-зависимые ДНК-полимеразы (обратные транскриптазы)

Получение библиотеки кДНК (перевод информации с матричных РНК на молекулярные структуры ДНК) осуществляется с помощью ферментов — обратных транскриптаз. Эти ферменты были выделены из РНК-содержащих вирусов. Ферменты синтезируют комплементарную цепь ДНК на матрице РНК. Так же, как и в случае ДНК-полимераз, необходим праймер, обеспечивающий наличие 3-гидроксильной группы, с которой образуется фосфодиэфирная связь. Обычно на концах мРНК эукариотических организмов находится участок полирибоадениловой кислоты. Это позволяет использовать в качестве обобщенного праймера короткую цепочку полидезоксириботимидиновой кислоты.

Продолжение ниже

Ферменты в нетрадиционных средах. Мицеллярная энзимология

Ферменты в естественных условиях работают в водной среде или на границе раздела фаз мембрана — водная среда. Развитие ме­тодов химической ...

Читать дальше...

всё на эту тему


Для того чтобы записанная в ДНК информация нашла свое молекулярное выражение и экспрессировалась в виде белка, были созданы специальные генетические конструкции, получившие название векторов.

Наиболее развита генетическая инженерия бактерий, при этом бактерия Е. coli является абсолютным рекордсменом по популярности в генетической инженерии. Для генетической инженерии бактерии используют ряд векторов.

Плазмиды. Это циклические ДНК, передаваемые клетками друг другу в рамках конъюгационного процесса. Бактериальные плазмиды были открыты, когда было обнаружено, что клетки способны передавать друг другу фактор устойчивости к антибиотикам. Было показано, что устойчивые к антибиотикам клетки содержат генетические элементы, не связанные с хромосомной ДНК. Эти элементы способны реплицироваться (размножаться) в клетке, увеличивая число своих копий.

Устойчивость к антибиотикам связана с наличием в плазмиде гена фермента, разрушающего тот или иной антибиотик. Гены устойчивости к антибиотикам возникли, по-видимому, в процессе эволюции и обеспечивают клеткам, несущим этот ген, возможность расти на средах, содержащих тот или иной антибиотик или их композицию. Природные плазмиды содержат от одного до нескольких генов устойчивости к антибиотикам.

Идеальный плазмидный вектор содержит один, а лучше два селектирующих маркера. Селектирующими маркерами являются гены устойчивости к антибиотикам. Наличие селектирующего маркера позволяет отобрать клетки (клоны), прошедшие стадию трансфекции, т.е. клетки, содержащие плазмиду, несущую вводимый чужеродный ген и ген устойчивости к антибиотику. После введения плазмид в клетки их размножение ведут в присутствии антибиотика, что позволяет выявить трансформированные вектором клетки.

Идеальный плазмида-вектор должен содержать лишь один центр рестрикции той или иной специфической рестриктазой. Это позволяет разрезать кольцевую ДНК плазмиды по этому центру с последующим введением чужеродного гена и дотированием. Рестриктазами различной специфичности молекула ДНК может быть разрезана на отдельные фрагменты, которые можно разделить по размерам с помощью гель-электрофореза.

Таким образом, процессы разрезания ДНК проводят с помощью гидролитических ферментов рестриктаз, последующее сшивание различных участков рекомбинантной ДНК осуществляютлигазы. Плазмид pNB2 является уменьшенной дочерней частью pNBl.

Существенную роль в работе плазмид играют процессы регуляции транскрипции. Современные векторы на основе плазмид содержат область промотора. Промотор — это нуклеотидная последовательность, с которой связывается РНК-полимераза в процессе транскрипции. Эффективная экспрессия чужеродного гена предполагает эффективный процесс транскрипции, который начинается при связывании РНК-полимеразы с областью промотора. Регуляция экспрессии также включает стадию индуцирования синтеза. В этом случае промоторная область блокируется белком-репрессором. Репрессор прочно связывается с областью инициации транскрипции, конкурентно вытесняя РНК-полимеразу. Для индукции экспрессии в систему вводят низкомолекулярные индукторы. Распространенными являются репрессоры. Индуктор прочно связывается с репрессором, вытесняя его из области связывания РНК-полимеразы.

При использовании в структуре плазмиды двух селектирующих маркеров (двух генов — ферментов, разрушающих антибиотики) чужеродный ген обычно вставляют в область одного из селектирующих маркеров. Это позволяет «отфильтровать» эффективно трансформированные клетки от клеток, получивших плазмиды без вставки, и от клеток, не получивших плазмиду вообще.

Значительное развитие получили векторы на основе вирусов бактерий — бактериофагов (фагов). Фаги пред­ставляют собой молекулы ДНК, упакованные в белковую оболочку, несущие гены структурных вирусных белков (капсидные белки), ферментов, участвующих в репликации ДНК, и литических ферментов, обеспечивающих разрушение (лизис) инфицированных клеток. В геноме фагов существуют необязательные частицы, которые могут быть удалены и заменены на чужеродные гены. Преимуществом векторов на основе бактериофагов является высокая эффективность переноса рекомбинантных ДНК в клетки хозяина, а также высокая эффективность размножения фаговых ДНК (большое число копий). Наибольшее распространение получили векторы на основе фагов X и М13. Векторы получены на основе модификаций геномов дикого типа. В геном вектора встроен сегмент длиной 42 пары нуклеотидов, так называемый полилинкер, или мультиклонирующий сайт, для включения фрагментов ДНК с соответствующими «липкими» концами. Полилинкер содержит несколько центров узнавания для уникальных рестриктирующих эндонуклеаз.

Уникальной особенностью векторов на основе фага М13 является возможность получения одноцепочечных циклических ДНК. Двухцепочечные рекомбинантные ДНК при формировании зрелых фаговых частиц превращаются в одноцепочечные. Это свойство векторов данного типа было использовано при создании методологии сайт-направленного мутагенеза — специфической замене одной аминокислоты в полипептидной цепи.

Поскольку каждый из векторов плазмидного или фагового типа имеет преимущества и недостатки, были сконструированы гибридные векторы, обладающие преимуществами того и другого вектора. Космиды — векторы, использующие эффективный плазмидный тип репликации и способные упаковываться invitro в оболочки частиц фага X. Это обеспечивает им высокую степень трансформации клеток. Фагмиды — гибриды между плазмидой и фагом, содержащие гены, необходимые для литической инфекции, и линеаризованную плазмиду. Фагмиды часто содержат ген температурочувствительного репрессора — белка, инактивирующегося при повышенной температуре. В этом случае фагмида реплицируется как плазмида при низкой температуре и как фаг при высокой.

Таким образом, в арсенале исследователей, работающих в области генетической инженерии, имеются большой набор ферментов, специфически модифицирующих ДНК, и особые методы введения чужеродного гена в клетку, обеспечивающие его эффективную экспрессию.




© Авторы и рецензенты: редакционный коллектив оздоровительного портала "На здоровье!". Все права защищены.


 
Текст сообщения*
Защита от автоматических сообщений
Загрузить изображение
 

nazdor.ru
На здоровье!
Беременность | Лечение | Энциклопедия | Статьи | Врачи и клиники | Сообщество


О проектеКарта сайта β На здоровье! © 2008—2015
nazdor.ru, nazdor.com
Контакты Наш устав

Рекомендации и мнения, опубликованные на сайте, являются справочными или популярными и предоставляются широкому кругу читателей для обсуждения. Указанная информация не заменяет квалифицированную медицинскую помощь, основанную на истории болезни и результатах диагностики. Обязательно проконсультируйтесь с врачом.

Размещенные на сайте информационные материалы, включая статьи, могут содержать информацию, предназначенную для пользователей старше 18 лет согласно Федеральному закону №436-ФЗ от 29.12.2010 года "О защите детей от информации, причиняющей вред их здоровью и развитию".