Пользовательский поиск

Ферменты — инструменты генетической инженерии

Успехи генетической инженерии стали возможны благодаря изучению ферментов, позволяющих проводить химические операции с генетическим материалом. В генетической инженерии используется большая группа ферментов, способных гидролизовать, «разрезать» молекулы ДНК и РНК по специфическим центрам, «сшивать» фрагменты нуклеиновых кислот с образованием фосфодиэфирных связей, проводить полимеризацию нуклеотидов на матрице одноцепочечной ДНК или РНК. Совокупность этих свойств ферментов позволяет манипулировать ДНК, проводить ее модификацию.

Продолжение ниже

Ферменты в нетрадиционных средах. Мицеллярная энзимология

Ферменты в естественных условиях работают в водной среде или на границе раздела фаз мембрана — водная среда. Развитие ме­тодов химической ...

Читать дальше...

всё на эту тему


Рестриктирующие эндонуклеазы (рестриктазы)

Это гидролазы, способные специфически сорбироваться на определенных последовательностях двухцепочечных молекул ДНК и гидролизовать определенные связи. Ферменты «узнают» короткие нуклеотидные последовательности ДНК и гидролизуют фосфодиэфирные связи в области этих последовательностей.

В настоящее время известно около 400 ферментов типа рестриктаз, способных расщеплять молекулу ДНК примерно в 90 различных центрах узнавания.

Ферменты выделяют из различных бактерий, что отражено в их названиях.

Классическим примером рестриктаз является эндонуклеаза ЈcoRI. Этот фермент гидролизует ДНК в тех местах, где встречается последовательность 5'—GAATTC—3'. Эта последовательность является палиндромной, т.е. в обеих цепях точно напротив друг друга находятся одинаковые последовательности, читаемые в разных направлениях.

Разрезание молекулы ДНК происходит вдва этапа. Вначале гидролизуется одна цепь, потом — другая. Как видно, продуктами реакции являются два двухцепочечных фрагмента с комплементарными одноцепочечными концами 5'—ААТТ—3'. Одноцепочечные концы такого типа называют «липкими». Фрагменты, полученные в результате действия ZfcoRI из двух разных ДНК, могут соединиться водородными связями и в дальнейшем могут образовать химическую связь под действием лигазы. Эндонуклеаза EcoRl представляет димер, который имеет молекулярную массу 31000. Белок образует комплекс с центром ДНК протяженностью около десяти пар, внутри этой последовательности находится специфический центр узнавания. Каталитический центр фермента образован комплексом ионов Mg + с карбоксильными группами аспарагиновой кислоты.Центр сорбции в активном центре фермента формируется аргинином и глутаминовой кислотой, образующими водородныесвязи с основаниями вспецифическом центре рестрикции.

Большой набор рестриктаз обеспечивает возможность выборапри формировании различных «липких» концов.

В генетической инженерии также применяются рестриктазы, разрезающие фосфодиэфирную связь в середине «узнаваемой» последовательности. В результате возникают фрагменты ДНК с «тупыми» двухцепочечными концами.

Применение эндонуклеаз различной специфичности обеспечивает возможность разрезания молекулы ДНК на фрагменты различной длины. Полученные фрагменты могут быть разделены методом электрофореза, выделены и на следующем этапе включены в различные рекомбинантные ДНК-конструкции. Сшивку различных фрагментов ДНК осуществляют ферменты, получившие название лигаз.

ДНК-лигазы. Объединение различных фрагментов ДНК invitroосуществляют с помощью лигаз. В случае если фрагменты ДНК имеют «липкие» концы, два одноцепочечных участка могут образовывать комплекс за счет комплементарных взаимодействий с помощью водородных связей. Комплекс может быть трансформирован в прочную химическую связь под действием ДНК-лигазы. Фермент катализирует образование фосфодиэфирных связей между соединенными нуклеотидами. Поскольку процесс является обратным гидролизу и в водной среде термодинамически невыгоден, реакция идет с расходом АТФ (иногда НАД+). Каталитически важной группой является Е—NH2- группа лизина. На первой стадии процесса происходит аденилирование активного центра.

Существуют лигазы, способные провести сшивку двух фрагментов ДНК с «тупыми» концами. Наиболее известна в этом плане ДНК-лигаза фага Т4, соединяющая «тупые» концы двуцепочечной ДНК.

ДНК-полимеразы. Эти ферменты осуществляют синтез второй молекулы ДНК на матрице первой. Необходимым условием реакции является наличие праймера, комплементарного концу полимерной цепи. Фермент достраивает вторую цепь, имея дуплекс в качестве «затравки» реакции.




© Авторы и рецензенты: редакционный коллектив оздоровительного портала "На здоровье!". Все права защищены.


 
Текст сообщения*
Защита от автоматических сообщений
Загрузить изображение
 

nazdor.ru
На здоровье!
Беременность | Лечение | Энциклопедия | Статьи | Врачи и клиники | Сообщество


О проектеКарта сайта β На здоровье! © 2008—2015
nazdor.ru, nazdor.com
Контакты Наш устав

Рекомендации и мнения, опубликованные на сайте, являются справочными или популярными и предоставляются широкому кругу читателей для обсуждения. Указанная информация не заменяет квалифицированную медицинскую помощь, основанную на истории болезни и результатах диагностики. Обязательно проконсультируйтесь с врачом.

Размещенные на сайте информационные материалы, включая статьи, могут содержать информацию, предназначенную для пользователей старше 18 лет согласно Федеральному закону №436-ФЗ от 29.12.2010 года "О защите детей от информации, причиняющей вред их здоровью и развитию".