Пользовательский поиск

Выделение и амплификация гена. Библиотека генов

К семидесятым годам прошлого столетия в основном сформировались представления о механизмах записи и молекулярного считывания генетической информации. Многочисленные исследования показали, что информация о структуре белка закодирована в двухцепочечных молекулах ДНК. Размножение (копирование) этой информации связано с процессами репликации — перехода двухцепочечной ДНК в две одноцепочечные субъединицы и достраивания вторых цепей на матрице первых. Процесс синтеза белка включает стадию транскрипции — синтеза молекулы матричной РНК (мРНК), комплементарной молекуле ДНК. Синтез белка осуществляется специализированной молекулярной машиной — рибосомой, при этом последовательность аминокислот полипептидной цепи задается последовательностью нуклеотидов матричной РНК. Этот процесс получил название трансляции. В генетическом коде каждой аминокислоте соответствует кодон — триплет (или группа триплетов) нуклеотидов. Соответствие между аминокислотой и кодоном обеспечивается группой высокоспецифических ферментов — аминоацил-тРНК-синтетазами. Ферменты этого типа способствуют химическому взаимодействию между транспортной РНК (тРНК) и аминокислотой с образованием аминоацил-тРНК. На рибосоме происходит комплементарное присоединение аминоацил-тРНК к мРНК на основе нуклеотид-нуклеотидного узнавания и образование пептидной связи. Процесс синтеза пептидной связи идет с расходом общего энергетического посредника — АТФ. Синтезированная полипептидная цепь удаляется с рибосомы, образуя вторичную, третичную структуру, т. е. формируя структуру белка. Ограничение полипептидной цепи от начала (N-конца) до С-конца осуществляется с помощью стоп-кодонов (UAA, UAG, UGA).

Продолжение ниже

Генетика

... древнегреческого genetikos γενετικός, «родительный падеж», что от γένεσις генезис, «происхождение»), - это, наука о генах, изменчивости живых организмов, наследственности и дисциплина биологии. Генетика исследует молекулярную структуру и функции генов,...

Читать дальше...

всё на эту тему


Вся эта, на первый взгляд, довольно сложная, но стройная система процессов приводит к экспрессии генетической информации по принципу один ген — один белок.

Последовательности генов организованы в геномы. Возникают в высшей степени интригующие вопросы: возможен ли перенос гена или группы генов из организма одного вида в организм другого вида; возможна ли экспрессия этих генов. Ответы на эти вопросы и составляют основу новой области знания, получившей название генетической инженерии. Довольно быстро были разработаны методы специфической идентификации гена, методы «разрезания» и «склеивания» ДНК с помощью ферментов (получения рекомбинантных ДНК), созданы генетические конфигурации, обеспечивающие введение новой генетической информации в клетки и высокую эффективность экспрессии новых генов. Для химической энзимологии существенным было создание методов сайт-специфического мутагенеза, т.е. создание возможности замены одной аминокислоты на другую в полипептидной цепи. Разработанные методы стали использоваться в первую очередь для получения и исследования ферментов. Развитие генетической инженерии (или технологии рекомбинантных ДНК) привело к тому, что генетическая инженерия стала рядовым методом химической энзимологии.

Источником ДНК для генно-инженерных операций являются геномы различных организмов. Геном может быть превращен в библиотеку генов путем ферментативного гидролиза ДНК или РНК и включения полученных фрагментов в соответствующие векторы. Различают две основные разновидности библиотек генов: геномные библиотеки и библиотеки кДНК. Геномные библиотеки получают путем расщепления геномной ДНК с помощью гидролаз рестриктазного типа с последующим включением полученных фрагментов в циклические генетические конфигурации типа плазмид, фаговых векторов и др. Получение библиотек кДНК предполагает промежуточную стадию обратной трансформации генетической информации, записанной на мРНК, в форму ДНК с помощью фермента — обратной транскриптазы. Библиотеки кДНК включают не весь геном, а только активированные гены, которые хорошо экспрессируются и дают относительно высокий уровень мРНК. В этом случае из клетки выделяют фракцию мРНК, с помощью фермента «обратная транскриптаза» на матрице мРНК синтезируют фрагменты ДНК, строго соответствующие структуре белков, и включают полученные гены в плазмидные или фаговые векторы. Библиотека генов в форме кДНК является предельно удобной, поскольку исключает все возможные балластные структуры, Представленные в геноме, например интроны. Дело в том, что в процессе транскрипции (синтеза мРНК с матрицы ДНК) происходит исключение интронов, и ген получается в чистом виде.

Полученный набор векторов с включенным в них искомым геном вводится в клетки, и отбор нужной клетки, экспрессирующей тот или иной ген, проводится в процессе клонирования.

В том случае, если имеется информация о первичной структуре искомого белка (или его близкого гомолога), применяют более эффективный метод, основанный на амплификации гена с помощью ДНК-полимеразы. Существенный прогресс в этой области был достигнут при открытии и исследовании ДНК-полимераз из термофильных микроорганизмов. Обладая высокой термостабильностью, ДНК-полимераза термофилов допускает нагревание образца фермента до температуры 80—90 °С. В этих условиях двухцепочечные фрагменты ДНК «плавятся» и переходят в одноцепочечную форму. Фермент ДНК-полимераза осуществляет синтез второй цепи ДНК на матрице первой. Таким образом, в рамках одного цикла получение из одной молекулы ДНК двух копий. При повторном цикле число копий врастет в геометрической профессии: N= 2n , где п — число циклов. Реакция получила название полимеразной цепной реакции. Особенность этой реакции заключается в том, что в результате реакции удается увеличить число копий искомого гена в десятки тысяч раз и тем самым использовать для дальнейших генно-инженерных операций значительное количество ДНК. Это особенно важно, когда в исходном образце генетического материала очень мало.

ДНК-полимераза не способна работать с «чистого листа». Она только продолжает двойную цепь, ей необходима комплементарная «затравка», т. е. наличие двойной цепи на фрагменте амплифицируемой ДНК. Это дает возможность из гигантской смеси генов, представленных во фрагментированном геноме, выбрать нужный. Если имеется информация о последовательности аминокислот в искомом белке или соответственно информация о последовательности нуклеотидов в гене, выбор нужного белка осуществляют с использованием праймеров — одноцепочечных фрагментов ДНК, соответствующих началу и концу полипептидной цепи. Добавляя в реакционную среду праймеры, создают условия для комплексообразования праймеров с искомой фракцией ДНК, это обеспечивает точку начала и окончания работы ДНК-полимеразы. Технологический прием, основанный на использовании термостабильной ДНК-полимеразы, революционизировал методы выделения генов и молекулярно-генетический анализ.

Применение термостабильной ДНК-полимеразы из термофильных бактерий Thermusaquaticus позволяет провести много цикловамплификации при однократном введении фермента. Смесь ДНК, дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, избытка праймеров и ДНК-полимеразы нагревают до температуры плавления ДНК и образования одноцепочечных форм. Затем смесь охлаждают, достигая комплексообразования праймеров, так называемого «отжига», с одноцепочечными формами ДНК. Далее температуру поднимают для оптимального синтеза второй цепи. Цикл повторяют многократно в течение нескольких часов. Таким образом, получаются микрограммовые количества копий ДНК из единственной молекулы.




© Авторы и рецензенты: редакционный коллектив оздоровительного портала "На здоровье!". Все права защищены.


 
Текст сообщения*
Защита от автоматических сообщений
Загрузить изображение
 

nazdor.ru
На здоровье!
Беременность | Лечение | Энциклопедия | Статьи | Врачи и клиники | Сообщество


О проектеКарта сайта β На здоровье! © 2008—2015
nazdor.ru, nazdor.com
Контакты Наш устав

Рекомендации и мнения, опубликованные на сайте, являются справочными или популярными и предоставляются широкому кругу читателей для обсуждения. Указанная информация не заменяет квалифицированную медицинскую помощь, основанную на истории болезни и результатах диагностики. Обязательно проконсультируйтесь с врачом.

Размещенные на сайте информационные материалы, включая статьи, могут содержать информацию, предназначенную для пользователей старше 18 лет согласно Федеральному закону №436-ФЗ от 29.12.2010 года "О защите детей от информации, причиняющей вред их здоровью и развитию".