Химическая модификация аминокислот белков

Особый этап в развитии химической энзимологии и химии белка связан с разработкой реакций химического превращения функциональных групп аминокислот полипептидной цепи. Эти реакции широко используются для идентификации функциональных групп, определяющих каталитическую активность ферментов. Кроме того, эти реакции позволили разработать методы манипулирования белками в практических целях (химическое «сшивание» белков с различными носителями, получение конъюгатов белков и т.п.).

Свободная аминогруппа N-концевой аминокислоты, е-аминогруппа лизина

Эти группы - частый объект модификации.

Хромофорные и флуоресцентные метки. Несколько реакций функциональных групп аминокислот сыграли ключевую роль в изучении структуры белков и идентификации природы каталитических групп активного центра. (Здесь и далее Р — белок.) Таким образом, можно ввести хромогенную метку в N-концевую аминогруппу пептида. Аналогично себя ведет е-аминогруппа лизина. Это соединение устойчиво в кислой среде. После кислотного гидролиза пептида или белка удается выделить окрашенный продукт и идентифицировать природу N-концевой аминокислоты. Проводя реакции с пептидами — продуктами частичного гидролиза белков, можно установить последовательность аминокислот в белке. Так была определена последовательность аминокислот в инсулине (Ф. Сенгер, Нобелевская премия по химии 1958 г.).

Отщепление N-концевой аминокислоты. Реакция с участием N-концевой аминогруппы была введена в практику П. Эдманом. Реакция позволяет химически модифицировать N-концевую аминокислоту и отделить ее от полипептидной цепи. В качестве реагента был использован фенилизотиоцианат.

В кислой среде продукт первой стадии реакции превращается в циклическое соединение и отщепляется в форме фенилтиогидантоина, соответствующего N-концевой аминокислоте.

Реакции с альдегидами с последующим восстановлением азометиновых связей. В химии белка часто используют реакцию аминогрупп с альдегидом.

Реакцию проводят в слабощелочной либо щелочной среде. Поскольку получающийся продукт не устойчив в нейтральной и слабокислой среде, на второй стадии реакции проводят восстановление азометиновых связей боргидридом натрия. Конечным продуктом реакции является устойчивый вторичный амин.

Реакции с имидоэфирами. Реакция идет в слабощелочной среде при pH 8,5.

Реакции с ангидридами кислот. Реакцию проводят в большом избытке галогенангидрида кислоты, поскольку в водной среде последний гидролизуется.

Реакцию используют для введения в белок фрагмента с двойной связью, который в дальнейшем может быть использован для включения белков в различные полимерные матрицы за счет радикальной полимеризации непредельных соединений.

Реакции с ангидридами дикарбоновых кислот. Реакция с цитраконовым ангидридом протекает следующим образом: (Напомним, что при pH 7 аминогруппа протонирована — заряжена положительно, карбоксильная группа депротонирована — заряжена отрицательно.)

Защита аминогруппы. Иногда бывает необходимо провести химическую модификацию а-аминогруппы или карбоксильной группы, не затронув при этом свободную (концевую) аминогруппу. Например, это важно в пептидном синтезе при наращивании цепи в нужном направлении. Для этого сначала проводят реакцию, защищающую свободную аминогруппу. Наиболее часто используется третбутилоксикарбонильная защита. Свободную аминогруппу ацилируют ангидридом третбутилового эфира угольной кислоты.

Карбоксильная группа С-конца полипептидной цепи, карбоксильные группы аспарагиновой и глутаминовой кислот

Свободные карбоксильные группы белков могут быть модифицированы реакцией этерификации или амидирования. Однако наибольшее распространение получили реакции, в результате которых увеличивается способность карбоксильных групп к взаимодействию с аминогруппами аминокислот с образованием пептидных связей. Речь идет о реакциях с участием карбодиимидов и изоксазолов.

Фенольная группа тирозина.Химические свойства тирозина определяются возможностями фенольной группы. Основные реакции химической модификации в данном случае это реакции электрофильного замещения в ароматическом кольце.

Хорошим алкилирующим агентом является также этиленимин.

В результате модификации галогенуксусной кислотой в нейтральном растворе белковая молекула приобретает отрицательный заряд (за счет ионизированной при pH 7 карбоксильной группы); в случае модификации этиленимином — положительный (за счет протонированной аминогруппы).

Очень важный реагент для маркировки и количественного определения свободных SH-групп был предложен Дж. Эллманом (реактив Эллмана — 5,5-дитио-бис-(2-нитробензойная кислота)). Реагент взаимодействует со свободными SH-группами стехиометрически с образованием хромогенного продукта. Эта реакция позволяет определить число сульфгидрильных групп в образце.